柳枝稷發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中纖維素降解機制及微生物多樣性變化

【摘要】：研究纖維素高效降解和甲烷高效生成的微生物群落結構是解決木質(zhì)纖維素利用率低和產(chǎn)氣量低的關鍵問題。本試驗以結實期和拔節(jié)期的柳枝稷為粗飼料分別進行飼喂試驗,收集馴化后的瘤胃液開展體外發(fā)酵試驗,分析兩種瘤胃發(fā)酵液在木質(zhì)纖維素降解及甲烷生產(chǎn)方面的差別,并與傳統(tǒng)沼液發(fā)酵過程生產(chǎn)性能進行對比,進一步通過高通量測序技術分析三種發(fā)酵液中微生物種群結構與多樣性的差別,為揭示高效降解木質(zhì)纖維素,提高甲烷產(chǎn)量的微生物群落結構的研究提供理論依據(jù)。 試驗一、瘤胃液與沼液厭氧發(fā)酵效果的對比研究。分別以高、低木質(zhì)纖維素柳枝稷馴化瘤胃液和沼液為發(fā)酵接種物,柳枝稷為發(fā)酵底物,在37℃條件下發(fā)酵72h；測定發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量、氣體成分、揮發(fā)性脂肪酸、pH值、銨態(tài)氮、可溶性糖以及底物NDF和ADF值。結果表明：累積產(chǎn)氣量為低木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(265ml)高木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(157ml)沼液(120ml)。最高甲烷含量為沼液(33.76%)低木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(27.36%)高木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(24.05%)。最大固體分解量為低本質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(29.00%)高木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(28.71%)沼液(21.39%),瘤胃液固體分解量顯著高于沼液(P0.05)。另外,三種發(fā)酵液均表現(xiàn)為半纖維素分解率高于纖維素分解率,瘤胃液的纖維素和半纖維素最大分解率都顯著高于沼液(P0.05)；纖維素分解率為低木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(36.89%)高木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(32.32%)沼液(13.47%)；半纖維素分解率為低木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(34.86%)高木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液(33.60%)沼液(26.39%)。三種發(fā)酵液中VFA均呈現(xiàn)乙酸丙酸丁酸,且瘤胃液乙酸最大濃度顯著高于沼液(P0.05),結果表明瘤胃液中乙酸很少被利用,出現(xiàn)酸累積現(xiàn)象,導致發(fā)酵后期的pH迅速降低至5.5左右,氨態(tài)氮濃度升高到2.3g/l,反應體系受到抑制,發(fā)酵過程停止。沼液中的VFA能夠被很好的利用產(chǎn)生甲烷,使得pH穩(wěn)定在6.6左右,氨態(tài)氮濃度穩(wěn)定在1.8g/l。兩種馴化瘤胃液和沼液中的纖維素酶,半纖維素酶和果膠酶活性均為沼液低木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液高木質(zhì)纖維素馴化瘤胃液。 試驗二、瘤胃液與沼液微生物多樣性的對比研究。分別收集兩種馴化瘤胃液和沼液樣品,利用高通量技術進行基因組DNA序列分析,探討瘤胃液和沼液中細菌、真菌和古菌的多樣性。結果表明：瘤胃液的細菌主要分布在瘤胃球菌科(Ruminococcaceae),理研菌科(Rikenellaceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae),毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和BSll_gut_group,而沼液中細菌群落含量大于8%的科僅有瘤胃球菌科和理研菌科。兩種馴化瘤胃液的細菌群落的相似性很高,但瘤胃液與沼液細菌群落的相似性極低,三者的細菌群落物種豐富度都較高。高、低小質(zhì)纖維素馴化瘤胃液和沼液真菌都主要分布在Neocallimastigaceae,比例分別為48.36%、78.06%和67.15%,兩種馴化瘤胃液的真菌群落物種多樣性存在較大差別,瘤胃液和沼液間的真菌群落結構的相似性高于細菌和占菌。兩種馴化瘤胃液古菌物種間多樣性基本沒有差異,都含有很多未知古菌門和廣古菌門的古菌類,含量分別占到總古菌門的90.96%和86.99%。沼液古菌數(shù)量高于：瘤胃液,集中分布在以下幾個科Miscellaneous_Crenarchaeotic_Group_norank,甲烷粒菌科(Methanocorpusculaceae), Deep_Sea_Euryarchaeotic_Group,甲烷絲狀菌科(Methanosaetaceae)和Deep_Sea_Hydrothermal_Vent_Gp_6,以上菌群未在瘤胃液中發(fā)現(xiàn)；瘤胃液與沼液古菌群落多樣性差別很大,這可能是導致沼液中甲烷含量高于瘤胃液的原因。 綜上所述,兩種馴化瘤胃液的細菌、真菌和古菌的物種多樣性均高于沼液。瘤胃液球菌科,理研菌科,普雷沃氏菌科和毛螺旋菌科細菌的增多可能有利于纖維素降解；瘤胃液球菌科和Neocallimastigaceae微生物種類和數(shù)量增加對纖維素降解起主要作用；Miscellaneous_Crenarchaeotic_Group_norank,甲烷粒菌科和甲烷絲狀菌科的古菌種類及數(shù)量的增多有利于甲烷的生成。低木質(zhì)纖維素柳枝稷馴化瘤胃液微生物群落對木質(zhì)纖維素的利用率最高,沼液微生物群落產(chǎn)甲烷的能力最強。 【關鍵詞】：瘤胃液 沼液 木質(zhì)纖維素 甲烷 微生物多樣性
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S816
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 縮略詞表11-12
• 第一章 緒論12-27
• 1.1 研究背景與意義12-13
• 1.2 沼氣的研究與發(fā)展現(xiàn)狀13-14
• 1.2.1 甲烷、沼氣與生物天然氣內(nèi)涵13
• 1.2.2 沼氣的地位及發(fā)展現(xiàn)狀13-14
• 1.3 草類能源植物研究與發(fā)展現(xiàn)狀14-17
• 1.3.1 概念14
• 1.3.2 特征14
• 1.3.3 木質(zhì)纖維素結構與降解14-15
• 1.3.4 能源植物柳枝稷的研究與發(fā)展現(xiàn)狀15-17
• 1.4 降解纖維素和產(chǎn)甲烷的微生物研究進展17-20
• 1.4.1 細菌17-18
• 1.4.2 真菌18
• 1.4.3 甲烷菌18-19
• 1.4.4 瘤胃微生物應用于甲烷生產(chǎn)的研究19-20
• 1.5 瘤胃液體外厭氧發(fā)酵方法的研究20
• 1.6 木質(zhì)纖維素產(chǎn)甲烷的發(fā)酵機理研究20-22
• 1.7 分子生物學技術在微生物多樣性研究中的應用22-25
• 1.7.1 宏基因組學概念23
• 1.7.2 高通量測序技術的發(fā)展23-24
• 1.7.3 Illumina MiSeq測序原理24
• 1.7.4 MiSeq技術在微生物多樣性分析中的應用24-25
• 1.8 研究目的、研究內(nèi)容和實施方案25-27
• 1.8.1 研究目的25
• 1.8.2 研究目標25
• 1.8.3 研究內(nèi)容25-26
• 1.8.4 技術路線26-27
• 第二章 瘤胃液與沼液厭氧發(fā)酵效果的對比研究27-56
• 2.1 前言27
• 2.2 材料與方法27-34
• 2.2.1 試驗材料27-28
• 2.2.2 試驗設計與方法28-29
• 2.2.3 測定指標及分析方法29-33
• 2.2.4 統(tǒng)計分析33-34
• 2.3 結果與分析34-53
• 2.3.1 三種發(fā)酵液對產(chǎn)氣率和累積產(chǎn)氣量的影響34-35
• 2.3.2 三種發(fā)酵液對氣體成分的影響35-37
• 2.3.3 三種發(fā)酵液對固體分解量和分解率的影響37-39
• 2.3.4 三種發(fā)酵液對木質(zhì)纖維素成分及灰分的影響39-42
• 2.3.5 三種發(fā)酵液對纖維素和半纖維素分解率的影響42-45
• 2.3.6 三種發(fā)酵液對揮發(fā)性脂肪酸的影響45-48
• 2.3.7 三種發(fā)酵液對總酸和pH的影響48-50
• 2.3.8 三種發(fā)酵液對可溶性糖和氨態(tài)氮的影響50-51
• 2.3.9 三種發(fā)酵液對酶活性的影響51-53
• 2.4 討論53-55
• 2.5 小結55-56
• 第三章 瘤胃液與沼液微生物多樣性的對比研究56-88
• 3.1 前言56
• 3.2 材料與方法56-60
• 3.2.1 兩種馴化瘤胃液和沼液基因組DNA提取57-60
• 3.2.2 分析項目60
• 3.3 結果與分析60-86
• 3.3.1 細菌群落多樣性的研究60-70
• 3.3.2 真菌群落多樣性的研究70-78
• 3.3.3 古菌群落多樣性的研究78-86
• 3.4 討論86-87
• 3.5 小結87-88
• 第四章 結論與展望88-89
• 4.1 結論88
• 4.2 創(chuàng)新點88
• 4.3 有待于進一步研究的問題88-89
• 參考文獻89-98
• 致謝98-99
• 個人簡介99

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