牦牛瘤胃厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物的多樣性及其纖維降解特性研究

【摘要】：青藏高原牦牛終年以放牧方式生活在海拔3000米以上的極端生態(tài)環(huán)境,棲息在瘤胃中的大量微生物使牦牛瘤胃成為高效降解木質(zhì)纖維素的天然發(fā)酵罐。其中,厭氧真菌是一種重要的木質(zhì)纖維素降解微生物。有研究認(rèn)為,與瘤胃真菌共生的一些甲烷菌能夠提高厭氧真菌纖維素降解活性,并促進木質(zhì)纖維素降解代謝轉(zhuǎn)化生成乙酸和甲烷。目前有關(guān)瘤胃厭氧真菌和甲烷菌之間的自然共存關(guān)系研究報道很少,為開發(fā)利用瘤胃內(nèi)高效降解木質(zhì)纖維素的優(yōu)質(zhì)真菌資源,本文首次以甘肅省天祝放牧牦牛為研究對象,利用亨氏厭氧滾管培養(yǎng)技術(shù),分離獲得了大量瘤胃厭氧真菌及甲烷菌自然共培養(yǎng)物,分析探討了厭氧真菌和甲烷菌之間的自然共存關(guān)系,并開展了這些共培養(yǎng)物對農(nóng)作物秸稈的木質(zhì)纖維素降解功效和消化代謝研究,主要研究結(jié)果如下:1.牦牛瘤胃共培養(yǎng)物的多樣性:自天祝全放牧牦牛瘤胃食糜液中分離獲得生長穩(wěn)定的厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物20個,通過形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS1序列分析鑒定厭氧真菌的種屬,通過PCR-DGGE技術(shù)和16Sr DNA序列分析與厭氧真菌共生的甲烷菌的多樣性和種類。20個共培養(yǎng)物包括4種組合類型:8個Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium,1個Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter millerae,8個Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium,3個Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium。2.高效共培養(yǎng)物的篩選:以小麥秸稈為生長底物,通過檢測產(chǎn)氣量、多糖水解酶活性、酯酶活性、干物質(zhì)降解率、酚酸釋放量、甲烷和乙酸產(chǎn)量,研究發(fā)現(xiàn)8個共培養(yǎng)Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium和3個共培養(yǎng)Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium比9個共培養(yǎng)Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium生長更加穩(wěn)定快速,表現(xiàn)出更強的秸稈纖維降解活性。自20個3屬真菌與甲烷菌共培養(yǎng)中,篩選出降解秸稈的3個高效共培養(yǎng)物分別為:O.joyonii Yak7+M.ruminantium,N.frontalis Yak16+M.ruminantium和Piromyces Yak18+M.ruminantium。3.高效共培養(yǎng)和相應(yīng)的真菌純培養(yǎng)對秸稈的降解能力比較:在上述2研究的基礎(chǔ)上,以小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈為底物,在7天培養(yǎng)期內(nèi),3個高效共培養(yǎng)物中N.frontalis Yak16+M.ruminantium表現(xiàn)出最強的降解秸稈木質(zhì)纖維素功能,產(chǎn)生最高活性木聚糖酶、濾紙纖維素酶、阿魏酸酯酶、乙酰酯酶、香豆酸酯酶、最高干物質(zhì)降解率、中性和酸性洗滌纖維降解率和最多的酚酸釋放量。甲烷菌M.ruminantium在不同程度上提高了3株厭氧真菌純培養(yǎng)降解秸稈的功能,尤其是真菌純培養(yǎng)N.frontalis Yak16本身以3種秸稈為底物具有較高干物質(zhì)降解率,而與甲烷菌M.ruminantium形成自然共培養(yǎng)后進一步顯著提高了真菌純培養(yǎng)N.frontalis Yak16的降解功能,使共培養(yǎng)物N.frontalis Yak16+M.ruminantium成為高效降解秸稈木質(zhì)素纖維素的最佳優(yōu)勢組合,最高值分別達到:以麥秸為底物木聚糖酶12500 m U,以玉米秸為底物濾紙酶430.3 m U,阿魏酸酯酶11.0 m U,乙酰酯酶199.3 m U,香豆酸酯酶5.0 m U,中性洗滌纖維降解率61.7%,酸性洗滌纖維降解率55.7%,阿魏酸釋放24.1 ug/m L和p-香豆酸釋放50.3μg/m L,以稻秸為底物的干物質(zhì)降解率71.9%。4.高效共培養(yǎng)物和相應(yīng)的真菌純培養(yǎng)降解秸稈所產(chǎn)代謝產(chǎn)物比較:在上述3研究的基礎(chǔ)上,以小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈為底物,在7天培養(yǎng)期內(nèi),3個高效共培養(yǎng)物相對應(yīng)的3個純培養(yǎng)真菌產(chǎn)生乙酸、乳酸、乙醇和氫氣產(chǎn)量依次是N.frontalis Yak16﹥Piromyces Yak18﹥O.joyonii Yak7,尤其是厭氧真菌純培養(yǎng)N.frontalis Yak16產(chǎn)生大量乙醇和乳酸,乙醇產(chǎn)量遠高于以前文獻報道。3個高效共培養(yǎng)產(chǎn)生乙酸、乳酸和甲烷產(chǎn)量依次是:N.frontalis Yak16+M.ruminantium﹥Piromyces Yak18+M.ruminantium﹥O.joyonii Yak7+M.ruminantium,尤其是共培養(yǎng)N.frontalis Yak16+M.ruminantium產(chǎn)生大量乙酸和甲烷,歸因于甲烷菌M.ruminantium改變了厭氧真菌的代謝途徑。根據(jù)上述結(jié)果,無論是厭氧真菌純培養(yǎng)N.frontalis Yak16,還是厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)N.frontalis Yak16+M.ruminantium都可能在提高木質(zhì)纖維素生物降解中具有重要的開發(fā)應(yīng)用價值。綜上所述,本文系統(tǒng)揭示了天祝放牧牦牛瘤胃厭氧真菌及甲烷菌之間的自然共生關(guān)系,并通過秸稈纖維降解對比試驗闡釋了牦牛瘤胃厭氧真菌在純培養(yǎng)或與甲烷菌共培養(yǎng)條件下對不同作物秸稈的降解能力差異和代謝轉(zhuǎn)化特性,為今后牦牛瘤胃微生物資源的開發(fā)利用與提高木質(zhì)纖維素降解功效提供了理論科學(xué)依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】：牦牛 瘤胃 厭氧真菌 甲烷菌 共培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.6
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文縮略表9-14
• 第一章 緒論14-38
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 文獻綜述16-34
• 1.2.1 牦牛16-18
• 1.2.2 秸稈和木質(zhì)纖維18-21
• 1.2.3 瘤胃厭氧真菌21-23
• 1.2.4 瘤胃厭氧真菌及其微生態(tài)學(xué)特性23-25
• 1.2.5 厭氧真菌對木質(zhì)纖維素的降解和消化代謝25-31
• 1.2.6 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)對木質(zhì)纖維素的降解及消化代謝31-34
• 1.3 研究意義34-36
• 1.3.1 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的多樣性研究34-35
• 1.3.2 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的秸稈消化代謝和降解功效35-36
• 1.4 研究內(nèi)容與目的36-37
• 1.4.1 研究目的36
• 1.4.2 研究內(nèi)容36-37
• 1.5 技術(shù)路線37-38
• 第二章 牦牛瘤胃厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的分離和鑒定38-56
• 2.1 引言38
• 2.2 材料與方法38-43
• 2.2.1 采樣地點概況與牦牛瘤胃液采集38-39
• 2.2.2 厭氧真菌培養(yǎng)基39
• 2.2.3 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的選育39-40
• 2.2.4 厭氧真菌形態(tài)學(xué)鑒定40
• 2.2.5 厭氧真菌分子生物學(xué)鑒定40-41
• 2.2.6 甲烷菌鑒定41-42
• 2.2.7 厭氧真菌和產(chǎn)甲烷菌進化關(guān)系分析42
• 2.2.8 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的掃描電鏡42-43
• 2.3 試驗結(jié)果43-54
• 2.3.1 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的分離純化43
• 2.3.2 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的鑒定43-49
• 2.3.3 厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物電鏡照49-51
• 2.3.4 厭氧真菌和甲烷菌進化關(guān)系分析51-54
• 2.4 討論54-55
• 2.5 小結(jié)55-56
• 第三章 牦牛瘤胃高效降解秸稈真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物的篩選56-72
• 3.1 引言56
• 3.2 材料與方法56-60
• 3.2.1 篩選方法及篩選培養(yǎng)基56-57
• 3.2.2 實驗設(shè)計和取樣57
• 3.2.3 真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物降解秸稈產(chǎn)氣量測定57
• 3.2.4 真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物降解秸稈產(chǎn)甲烷氣相測定57
• 3.2.5 真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物降解秸稈酶活測定57-59
• 3.2.6 真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物降解秸稈干物質(zhì)降解率測定59
• 3.2.7 真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物降解秸稈產(chǎn)揮發(fā)酸液相測定59
• 3.2.8 真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物降解秸稈釋放酚酸液相測定59-60
• 3.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析60
• 3.3 試驗結(jié)果60-68
• 3.3.1 高效共培養(yǎng)物的篩選60-63
• 3.3.2 高效共培養(yǎng)物纖維降解特性63-68
• 3.4 討論68-70
• 3.4.1 高效共培養(yǎng)物總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量68
• 3.4.2 高效共培養(yǎng)物酶活68-69
• 3.4.3 高效共培養(yǎng)物干物質(zhì)降解率69-70
• 3.4.4 高效共培養(yǎng)物酚酸釋放70
• 3.4.5 高效共培養(yǎng)物乙酸產(chǎn)量70
• 3.5 小結(jié)70-72
• 第四章 牦牛瘤胃真菌及甲烷菌共培養(yǎng)和厭氧真菌純培養(yǎng)降解秸稈功效研究72-91
• 4.1 引言72
• 4.2 材料與方法72-77
• 4.2.1 實驗設(shè)計和取樣73
• 4.2.2 秸稈基本營養(yǎng)成分測定73-74
• 4.2.3 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)氣量測定74
• 4.2.4 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈酶活測定74
• 4.2.5 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈纖維降解率測定74-77
• 4.2.6 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈釋放酚酸液相測定77
• 4.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析77
• 4.3 試驗結(jié)果77-85
• 4.3.1 秸稈基本營養(yǎng)成分測定77-78
• 4.3.2 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)氣量78-79
• 4.3.3 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈酶活79-81
• 4.3.4 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈纖維降解率81-83
• 4.3.5 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈酚酸釋放量83-85
• 4.4 討論85-89
• 4.4.1 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)產(chǎn)氣量85-86
• 4.4.2 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)干物質(zhì)降解率86-87
• 4.4.3 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)中性洗滌纖維降解率87-88
• 4.4.4 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)酸性洗滌纖維降解率88
• 4.4.5 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)酶活88-89
• 4.4.6 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)酚酸釋放量89
• 4.5 小結(jié)89-91
• 第五章 牦牛瘤胃真菌及甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈消化代謝研究91-111
• 5.1 引言91
• 5.2 材料與方法91-94
• 5.2.1 實驗設(shè)計和取樣91-92
• 5.2.2 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈氣體組分氣相測定92
• 5.2.3 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)揮發(fā)酸液相測定92
• 5.2.4 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)乙醇氣相測定92
• 5.2.5 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)乳酸液相測定92
• 5.2.6 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)琥珀酸液相-質(zhì)譜測定92-94
• 5.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析94
• 5.3 試驗結(jié)果94-108
• 5.3.1 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈氣體組分94-95
• 5.3.2 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)揮發(fā)酸95
• 5.3.3 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)乙醇95
• 5.3.4 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)乳酸95-96
• 5.3.5 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)降解秸稈產(chǎn)琥珀酸96
• 5.3.6 真菌-甲烷菌高效共培養(yǎng)所產(chǎn)甲烷，乙酸及木聚糖酶96-108
• 5.4 討論108-110
• 5.4.1 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)的氣體組分108
• 5.4.2 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)所產(chǎn)揮發(fā)酸和乙醇108-109
• 5.4.3 真菌-甲烷菌共培養(yǎng)和真菌純培養(yǎng)所產(chǎn)乳酸和琥珀酸109-110
• 5.5 小結(jié)110-111
• 第六章 主要研究結(jié)論及展望111-114
• 6.1 論文總結(jié)111-113
• 6.1.1 共培養(yǎng)物多樣性主要結(jié)論111
• 6.1.2 高效降解秸稈共培養(yǎng)物篩選主要結(jié)論111-112
• 6.1.3 高效共培養(yǎng)物降解秸稈功效主要結(jié)論112
• 6.1.4 高效共培養(yǎng)物降解秸稈消化代謝主要結(jié)論112-113
• 6.2 展望113-114
• 創(chuàng)新點114-115
• 參考文獻115-131
• 攻讀博士期間的科研成果131-132
• 致謝132

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