甲烷氧化菌素的生物合成及抗氧化活性研究

【摘要】： 利用甲基彎菌(Methylosinus trichosporium) IMV 3011合成甲烷氧化菌素(Methanobactin, mb),確立最佳發(fā)酵條件,建立了初步的甲烷氧化菌素分離富集方法,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。 甲烷氧化菌的甲烷單加氧酶(particulate methan monooxygenase, pMMO)能夠催化丙烯氧化成環(huán)氧丙烷。由于在有銅的存在下,mb會(huì)捕獲銅并將其帶入細(xì)胞傳遞給pMMO,構(gòu)建其活性中心。采用氣相色譜測(cè)定甲基彎菌IMV 3011在有無(wú)銅培養(yǎng)的條件下pMMO活性的改變,并分析了mb和pMMO活性的關(guān)系。 對(duì)比3011的生長(zhǎng)曲線和相對(duì)應(yīng)的mb積累曲線,確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為4天。在研究培養(yǎng)基中CuSO4的添加量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌mb的影響的實(shí)驗(yàn)中,確定在培養(yǎng)基中CuSO4的含量為0.5μmol/L時(shí),mb的產(chǎn)量相對(duì)最大。其中,全波長(zhǎng)掃描測(cè)得mb在280nm處有吸收峰,該波長(zhǎng)用于實(shí)驗(yàn)中mb的定量及含量比較。 碳源的選擇,對(duì)比甲烷、甲醇培養(yǎng)3011在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)及mb產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)甲醇馴化后的細(xì)菌形態(tài)上基本沒(méi)有變化,且甲醇作為碳源進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)3011時(shí),細(xì)胞的生長(zhǎng)及mb的積累均要好于甲烷搖床培養(yǎng)。 采用HP-20大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附法進(jìn)行mb富集實(shí)驗(yàn)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),確定10mL大孔樹(shù)脂最佳上樣量為500mL,最佳吸附時(shí)間為5h,洗脫劑的用量為20mL,大孔樹(shù)脂最佳解吸時(shí)間為1h。采用以上最佳富集條件,經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),制得mb含量較高的粗品,其最大產(chǎn)量為13mg/L。并繪制mb標(biāo)準(zhǔn)曲線,用以計(jì)算發(fā)酵液中的mb含量,并測(cè)出mb富集的最終得率,約為72.22%。加對(duì)CuSO4前后mb粗粉制得的溶液進(jìn)行HPLC分析,發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)峰在加入CuSO4后變小,該峰可能為mb的色譜峰,其保留時(shí)間為31.468min。 對(duì)mb抗氧化活性進(jìn)行研究。首先,通過(guò)NBT還原法與SOD試劑盒法的比較,確定采用實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定的試劑盒法測(cè)定甲烷氧化菌素SOD活性。對(duì)大孔樹(shù)脂富集前后甲烷氧化菌素的活性比較,發(fā)現(xiàn)富集過(guò)后的Cu-mb的SOD活性變小。在不同方法獲得Cu-mb的SOD活性的比較中,發(fā)現(xiàn)在富集前加入CuSO4結(jié)合成Cu-mb的效果要好。 采用DPPH法分析mb抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)Cu-mb具有清除DPPH自由基的能力,而且結(jié)果亦顯示富集前結(jié)合成Cu-mb的效果更好。而mb的自由基抑制率相對(duì)較小,不能確定其是否具有具有清除DPPH自由基活性。 對(duì)甲烷氧化菌素的食用油脂抗氧化性能評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示Cu-mb對(duì)豬油、豆油這兩種油脂具有抗氧化性(PF1),但是相對(duì)比較低。而mb的PF值雖然PF1,但近似等于1,故不能確定mb具有活性。 【關(guān)鍵詞】：甲烷氧化菌素 分離富集 抗氧化
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R151;TQ920.1
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-15
• 1.1 甲烷氧化菌素概況10-11
• 1.1.1 甲烷氧化菌10
• 1.1.2 甲烷氧化菌素的發(fā)現(xiàn)10
• 1.1.3 甲烷氧化菌素結(jié)構(gòu)特性10-11
• 1.2 甲烷氧化菌素的生物活性的研究現(xiàn)狀11-13
• 1.2.1 甲烷氧化菌素抗氧化活性11-12
• 1.2.2 甲烷氧化菌素的抗菌性12
• 1.2.3 甲烷氧化菌素的金屬螯合性12-13
• 1.3 本課題來(lái)源及研究的意義13-14
• 1.3.1 課題來(lái)源13
• 1.3.2 甲烷氧化菌素的研究意義13-14
• 1.4 論文的研究?jī)?nèi)容14-15
• 2 發(fā)酵獲得甲烷氧化菌素條件研究15-24
• 2.1 引言15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料15-16
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器15
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法16-18
• 2.3.1 甲烷氧化菌的培養(yǎng)條件16
• 2.3.2 甲烷氧化菌的pMMO活性16
• 2.3.3 甲烷氧化菌素含量測(cè)定方法16-17
• 2.3.4 甲烷氧化菌的生長(zhǎng)曲線與甲烷氧化菌素產(chǎn)量的關(guān)系17
• 2.3.5 銅對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)甲烷氧化菌素的影響17
• 2.3.6 碳源的選擇17-18
• 2.4 結(jié)果與分析18-23
• 2.4.1 甲烷氧化菌的pMMO活性18-19
• 2.4.2 甲烷氧化菌素全波長(zhǎng)掃描19-20
• 2.4.3 甲烷氧化菌的生長(zhǎng)曲線與甲烷氧化菌素產(chǎn)量的關(guān)系20-21
• 2.4.4 硫酸銅添加量對(duì)產(chǎn)甲烷氧化菌素的影響21-22
• 2.4.5 甲醇發(fā)酵罐培養(yǎng)甲烷氧化菌22-23
• 2.5 本章小結(jié)23-24
• 3 甲烷氧化菌素的分離富集24-31
• 3.1 引言24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料24
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料24
• 3.3 實(shí)驗(yàn)部分24-26
• 3.3.1 甲烷氧化菌素的分離富集24-25
• 3.3.2 甲烷氧化菌素富集參數(shù)確定25
• 3.3.3 甲烷氧化菌素的HPLC分析25-26
• 3.4 結(jié)果與分析26-29
• 3.4.1 大孔樹(shù)脂富集mb最佳條件26-28
• 3.4.2 大孔吸附樹(shù)脂制備甲烷氧化菌素粗品干粉28-29
• 3.4.3 甲烷氧化菌素的HPLC分析29
• 3.5 本章小結(jié)29-31
• 4 甲烷氧化菌素的抗氧化活性研究31-41
• 4.1 引言31
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料31
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器31
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料31
• 4.3 實(shí)驗(yàn)部分31-35
• 4.3.1 甲烷氧化菌素SOD活性研究31-33
• 4.3.2 DPPH法33-34
• 4.3.3 甲烷氧化菌素的食用油脂抗氧化作用34-35
• 4.4 結(jié)果與分析35-40
• 4.4.1 甲烷氧化菌素SOD活性研究35-37
• 4.4.2 DPPH法37-38
• 4.4.3 甲烷氧化菌素的食用油脂抗氧化作用38-40
• 4.5 本章小結(jié)40-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文45-46
• 致謝46

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