甲烷氧化菌的高密度培養(yǎng)

【摘要】：甲烷氧化菌和甲烷單加氧酶作為重要的多功能微生物催化劑,應(yīng)用潛力巨大,受到眾多研究機(jī)構(gòu)的關(guān)注。充分發(fā)揮甲烷氧化菌的作用,不僅可防治溫室氣體之害,還可獲取潔凈能源、塑料物質(zhì)、新型食品抗氧化劑、單細(xì)胞蛋白等,同時在污染治理方面(如三氯乙烯降解)也顯示出巨大的潛力。但由于甲烷氧化菌細(xì)胞生長速度慢、細(xì)胞密度低、發(fā)酵周期長,導(dǎo)致其在工業(yè)應(yīng)用中不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。本項目的研究內(nèi)容,構(gòu)建和完善甲烷氧化菌的快速、高密度培養(yǎng)體系。嘗試?yán)酶淖兗淄檠趸呐囵B(yǎng)條件,.改變培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量來確定其最佳工藝條件。甲烷氧化菌的高密度培養(yǎng)體系除了可以加速其在工業(yè)生物催化中的應(yīng)用,也必將提高甲烷氧化菌在環(huán)境甲烷控制應(yīng)用中的能力。 建立以甲烷為碳源的細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制,建立起一整套的測定細(xì)胞干重、生長速率、延滯期、甲烷氧化菌的甲烷單加氧酶(MMO)活性的方法。采用甲烷與甲醇共同作為碳源培養(yǎng)菌體,并加入甲烷傳遞體使甲烷更易于溶于細(xì)胞內(nèi),縮短延滯期,提高了發(fā)酵液的細(xì)胞密度和細(xì)胞的MMO活性。結(jié)果表明Methylosinus trichosporium 3011高密度培養(yǎng)的最佳條件如下Cu2+濃度為30μmol/L,甲醇的添加量為0.05%(V/V),石蠟油的添加量為2.5%(V/V)。此時細(xì)胞生長最好,生長速率為0.0460h-1,OD600值為1.827,細(xì)胞密度最高,細(xì)胞干重可以達(dá)到1.224gL-1,是未添加的6陪,其延滯期縮短,活性也有所提高。建立起以Dianion HP20大孔樹脂吸附、60%乙醇洗脫從發(fā)酵液中分離純化甲烷氧化菌素(methanobactin)的方法。將Methylosinus trichosporium3011提純出的methanobactin(無Cu)加入到含有30μmol/LCu2+的Methylosinus trichosporiu3011、Methylococcus capsulatus 3021、Methylosinus trichosporium OB3b和GYJ3的菌液中可影響它們的生長狀況,如：代時縮短,最終細(xì)胞濃度變大,生長速度加快。其活性也都有所增加,methanobactin使Cu進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi),調(diào)控使pMMO表達(dá)量變大,增加了MMO的環(huán)氧化能力。 【關(guān)鍵詞】：甲烷氧化菌 甲烷單加氧酶 高密度培養(yǎng) 甲烷傳遞體 甲烷氧化菌素
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：TQ221.11
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-17
• 1.1 甲烷10
• 1.2 甲烷氧化菌10-12
• 1.3 甲烷單加氧酶的結(jié)構(gòu)與調(diào)控12-13
• 1.3.1 MMO的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3.2 MMO的調(diào)控13
• 1.4 甲烷氧化菌及甲烷單加氧酶的應(yīng)用13-14
• 1.5 甲烷氧化菌培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀14-15
• 1.6 本課題來源、研究意義及內(nèi)容15-17
• 1.6.1 課題來源、研究意義15
• 1.6.2 本課題研究內(nèi)容15-17
• 第2章 甲醇為碳源對甲烷氧化菌生長的影響17-29
• 2.1 引言17
• 2.2 實驗材料與儀器17-18
• 2.2.1 實驗材料17
• 2.2.2 主要實驗儀器17-18
• 2.3 實驗方法18-21
• 2.3.1 培養(yǎng)基配方18
• 2.3.2 甲烷為碳源的細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立18-19
• 2.3.3 甲烷氧化菌的甲醇馴化培養(yǎng)19
• 2.3.4 甲醇為碳源的細(xì)胞發(fā)酵罐培養(yǎng)19-20
• 2.3.5 確定甲醇的最佳添加量20
• 2.3.6 甲醇添加時間的確定20
• 2.3.7 甲醇為碳源時細(xì)胞的生長與MMO活性20
• 2.3.8 發(fā)酵液中的甲醇含量與MMO活性的測定方法20-21
• 2.3.9 數(shù)據(jù)分析方式21
• 2.4 數(shù)據(jù)結(jié)果與分析21-27
• 2.4.1 甲烷為碳源的細(xì)胞生長狀況21-22
• 2.4.2 不同濃度甲醇為碳源對IMV3011生長的影響22
• 2.4.3 不同濃度甲醇為碳源對IMV3011生長延滯期的影響22-24
• 2.4.4 甲醇消耗狀況24
• 2.4.5 顯微鏡觀察24-25
• 2.4.6 氣相色譜測定MMO活性25-26
• 2.4.7 甲烷發(fā)酵體系中的酶活情況26-27
• 2.4.8 甲醇發(fā)酵體系中的酶活情況 #]827
• 2.5 本章小結(jié)27-29
• 第3章 銅離子含量對甲烷氧化菌生長的影響29-35
• 3.1 引言29
• 3.2 實驗器材與儀器29-30
• 3.2.1 實驗材料29
• 3.2.2 主要實驗儀器29-30
• 3.3 實驗方法30-31
• 3.3.1 培養(yǎng)基配方30
• 3.3.2 確定銅離子的最佳添加量30-31
• 3.3.3 細(xì)胞MMO活性的測定31
• 3.3.4 數(shù)據(jù)分析方式31
• 3.4 數(shù)據(jù)結(jié)果與分析31-34
• 3.4.1 不同濃度銅離子對IMV3011生長的影響31-32
• 3.4.2 不同濃度銅離子對IMV3011細(xì)胞生長延滯期的影響32-33
• 3.4.3 不同銅離子濃度對IMV3011MMO活性及細(xì)胞干重的影響33-34
• 3.5 本章小結(jié)34-35
• 第4章 甲烷傳遞體對甲烷氧化菌生長影響的研究35-43
• 4.1 引言35
• 4.2 實驗器材與儀器35-36
• 4.2.1 實驗材料35-36
• 4.2.2 主要實驗儀器36
• 4.3 實驗方法36-38
• 4.3.1 培養(yǎng)基配方36-37
• 4.3.2 確定甲烷傳遞體的最佳添加量37
• 4.3.3 細(xì)胞MMO活性的測定37
• 4.3.4 數(shù)據(jù)分析方式37-38
• 4.4 數(shù)據(jù)結(jié)果與分析38-41
• 4.4.1 不同濃度的甲烷傳遞體對IMV3011生長的影響38
• 4.4.2 不同濃度的甲烷傳遞體對IMV3011生長延滯期的影響38-40
• 4.4.3 不同濃度的甲烷傳遞體對IMV3011MMO活性及干重的影響40
• 4.4.4 甲醇和甲烷傳遞體共同對IMV3011生長的影響40-41
• 4.5 本章小結(jié)41-43
• 第5章 甲烷氧化菌素對甲烷氧化菌生長影響的研究43-55
• 5.1 引言43
• 5.2 實驗器材與儀器43-44
• 5.2.1 實驗材料43-44
• 5.2.2 主要實驗儀器44
• 5.3 實驗方法44-48
• 5.3.1 培養(yǎng)基配方44-46
• 5.3.2 甲烷氧化菌素的制取流程46-47
• 5.3.3 甲烷氧化菌素的檢測47
• 5.3.4 添加Mb、Cu~(2+)對甲烷氧化菌生長的影響47
• 5.3.5 Mb、Cu~(2+)對甲烷氧化菌pMMO活性影響的研究47-48
• 5.3.6 細(xì)胞MMO活性的測定48
• 5.3.7 數(shù)據(jù)分析方式48
• 5.4 結(jié)果與分析48-54
• 5.4.1 甲烷氧化菌素凍干成品48-49
• 5.4.2 Mb凍干品全波長紫外掃描圖譜49
• 5.4.3 甲烷氧化菌素的HPLC分析49-50
• 5.4.4 Mb、Cu~(2+)對IMV3011生長的影響50-51
• 5.4.5 Mb、Cu~(2+)對IMV3021生長的影響51-52
• 5.4.6 Mb、Cu~(2+)對GYJ3生長的影響52
• 5.4.7 Mb、Cu~(2+)對OB3b生長的影響52-53
• 5.4.8 Mb、Cu~(2+)對甲烷氧化菌pMMO活性影響53-54
• 5.5 本章小結(jié)54-55
• 結(jié)論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61-62
• 致謝62

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