甲烷氧化菌素檢測、生物合成及結(jié)構(gòu)表征

【摘要】：甲烷氧化菌和甲烷單加氧酶作為重要的多功能微生物催化劑,應(yīng)用潛力巨大,受到眾多研究機(jī)構(gòu)的關(guān)注。甲烷氧化菌素(mb)是甲烷氧化菌分泌的一種捕獲Cu的小分子肽。目前國際上對(duì)mb的研究剛剛起步,但由于還沒有分離純化出高純度的mb,因此對(duì)于mb還沒有一個(gè)通用檢測其含量的方法；另外,不同甲烷氧化菌所產(chǎn)生的mb的結(jié)構(gòu)和組成也會(huì)有一定的差別,本論文主要研究了mb的檢測方法建立、發(fā)酵合成及Methylosinus trichosporium3011菌種分泌的mb的初步結(jié)構(gòu)特征。本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容包括： 根據(jù)mb具有的銅結(jié)合特性,建立了一個(gè)液態(tài)快速檢測mb含量的方法,最適體系為chrome azurol S(CAS)、Cu2+、助色劑、緩沖溶液的添加量分別為2mL、1mL、4mL和0.5mL,反應(yīng)時(shí)間為15min,利用紫外-可見分光光度計(jì),在605nm波長下檢測mb的含量。該方法具有操作簡單、快速準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn),為mb發(fā)酵生產(chǎn)的研究提供依據(jù)。 采用CAS劈半平板法研究發(fā)現(xiàn)Methylosinus trichosporium3011(IMV3011)、 Methylosinus trichosporium OB3b(OB3b)、Methylococcus capsulatus3021(IMV3021)、 Methylomonas sp.GYJ3(GYJ3)這四種菌在使用nitrate mineral salt(NMS)培養(yǎng)基的情況下分泌mb的量相差不大,在一定量的Cu2+的培養(yǎng)基中,采用甲醇做為碳源時(shí),菌種的生長速度加快,mb的分泌量也較甲烷做碳源時(shí)的大。 以甲烷、甲醇分別作為碳源液態(tài)培養(yǎng)IMV3011時(shí)發(fā)現(xiàn),在Cu2+的濃度由0μM漸變到1.5μM的過程中,Cu2+濃度為0μM時(shí),二者的單位細(xì)胞產(chǎn)mb的量最大。將甲烷與甲醇作碳源的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),Cu2+濃度為0μM時(shí),甲烷培養(yǎng)液中的mb含量高于甲醇培養(yǎng)液的；而在Cu2+濃度達(dá)到1.5μM時(shí),甲醇培養(yǎng)中的mb分泌的總量卻高于甲烷培養(yǎng)的。Cu2+濃度從0μM增加到1.5μM的過程中,甲烷培養(yǎng)液中的mb產(chǎn)量變化量大于甲醇培養(yǎng)的。 由IMV3011菌株獲得的mb能夠促進(jìn)包括其在內(nèi)的4種甲烷氧化菌的顆粒性甲烷單加氧酶(pMMO)表達(dá),表明不同的甲烷氧化菌同樣能夠吸收來自于IMV3011的mb捕獲的銅,據(jù)此認(rèn)為mb可能不具有菌屬專一性。 采用固相萃取技術(shù)純化mb,結(jié)果表明,mb的固相萃取法的條件為洗脫液為60%乙腈水溶液,樣品流速為2mL/min,上樣量上限為200mL 采用液質(zhì)聯(lián)用儀、熒光光譜和紫外吸收光譜對(duì)mb的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測,結(jié)果表明,IMV3011菌分泌的mb分子量可能為846.1441,推測其分子式為C30H38N8O13S4 【關(guān)鍵詞】：甲烷氧化菌素 分泌能力 甲炕氧化菌 分離純化
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：Q93
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1 緒論11-20
• 1.1 甲烷11
• 1.2 甲烷氧化菌11-15
• 1.2.1 甲烷單加氧酶13-15
• 1.3 甲烷氧化菌素15-17
• 1.3.1 甲烷氧化菌素的發(fā)現(xiàn)15-16
• 1.3.2 甲烷氧化菌素的結(jié)構(gòu)16-17
• 1.4 本課題來源及研究的意義17-18
• 1.4.1 課題來源17
• 1.4.2 甲烷氧化菌素的研究意義17-18
• 1.5 論文的研究內(nèi)容18-20
• 2 甲烷氧化菌素的檢測20-34
• 2.1 引言20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料20-22
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器20
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 2.3.1 CAS分光光度法的建立22-24
• 2.3.2 劈半平板法檢測甲烷氧化菌素24-25
• 2.4 結(jié)果與分析25-32
• 2.4.1 吸收光譜的測定結(jié)果與分析25-27
• 2.4.2 甲烷氧化菌素線性關(guān)系確定結(jié)果27
• 2.4.3 CuSO_4添加量的測定結(jié)果27-28
• 2.4.4 絡(luò)合時(shí)間的測定結(jié)果28
• 2.4.5 助色劑HDTMA體積測定結(jié)果28-29
• 2.4.6 緩沖體系用量的選擇29
• 2.4.7 共存離子的影響29-30
• 2.4.8 工作曲線測定結(jié)果30
• 2.4.9 樣品分析結(jié)果30-31
• 2.4.10 不同甲烷氧化菌在以甲烷為碳源情況下產(chǎn)mb的比較31-32
• 2.4.11 甲烷氧化菌在不同碳源培養(yǎng)下分泌mb的比較32
• 2.5 本章小結(jié)32-34
• 3 銅離子濃度、碳源對(duì)甲烷氧化菌素產(chǎn)量的影響34-43
• 3.1 引言34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料34-35
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器34-35
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 3.3.1 甲烷氧化菌的培養(yǎng)35-36
• 3.3.2 大孔樹脂法純化甲烷氧化菌素36
• 3.3.3 MMO活性測定方法36
• 3.3.4 甲烷為碳源下Cu~(2+)對(duì)IMV 3011生長及發(fā)酵的影響36-37
• 3.3.5 甲醇為碳源下Cu~(2+)對(duì)IMV 3011生長及發(fā)酵的影響37
• 3.3.6 甲烷氧化菌素種屬專一性研究37-38
• 3.4 結(jié)果與分析38-42
• 3.4.1 氣相色譜測定環(huán)氧丙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線測定38-39
• 3.4.2 甲烷為碳源下Cu~(2+)對(duì)IMV 3011生長及發(fā)酵的影響39-40
• 3.4.3 甲醇為碳源下Cu~(2+)對(duì)IMV 3011生長及發(fā)酵的影響40
• 3.4.4 甲烷氧化菌素種屬專一性研究40-42
• 3.5 本章小結(jié)42-43
• 4 甲烷氧化菌素的純化、結(jié)構(gòu)表征研究43-52
• 4.1 引言43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料43-44
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器43-44
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料44
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 4.3.1 固相萃取法純化甲烷氧化菌素44-45
• 4.3.2 IMV 3011甲烷氧化菌素干粉液質(zhì)、熒光光譜、紫外的分析45-46
• 4.4 結(jié)果與分析46-51
• 4.4.1 固相萃取洗脫體系的確定46
• 4.4.2 固相萃取洗脫梯度的確定46-47
• 4.4.3 固相萃取處理量的確定47
• 4.4.4 固相萃取上樣速度的確定47
• 4.4.5 IMV 3011甲烷氧化菌素結(jié)構(gòu)表征47-51
• 4.5 本章小結(jié)51-52
• 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文58-59
• 致謝59

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