嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌的分離純化和二硫鍵異構(gòu)酶（MTH1745）的分子結(jié)構(gòu)和功能研究

【摘要】： 古菌其古老的進(jìn)化地位、奇特的生活習(xí)性和與此相關(guān)的潛在生物技術(shù)開發(fā)前景,賦予它迷人的科研價(jià)值。研究二硫鍵異構(gòu)酶與古菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和耐受性之間的關(guān)系,有利于揭示古菌適應(yīng)極端環(huán)境的分子機(jī)理。 本研究用Hungate厭氧操作技術(shù)從溫泉中分離純化了1株嗜熱產(chǎn)甲烷菌,命名為嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌DX01(Methanothermobacter thermoautotrophicus DX01)。該菌株培養(yǎng)在60℃時(shí)呈短桿狀,且菌落呈磚紅色。分析不同溫度生長(zhǎng)的細(xì)胞全蛋白質(zhì)圖譜,分離得到70℃時(shí)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)——甲基輔酶M還原酶Ⅰ。 使用標(biāo)準(zhǔn)菌株嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH~T全基因組序列,篩選了一個(gè)預(yù)測(cè)的ORF——MTH1745,被認(rèn)為是二硫鍵異構(gòu)酶。它含有一個(gè)Trx結(jié)構(gòu)域,編碼15一個(gè)氨基酸。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR從mRNA水平分析了MTH1745在冷激處理、不同生長(zhǎng)溫度情況下的表達(dá)特征。結(jié)果表明,當(dāng)溫度偏離菌體最適生長(zhǎng)溫度(65℃)或冷激處理(4℃)后,MTH1745 mRNA的表達(dá)量會(huì)提高,在50℃和70℃時(shí)達(dá)到最大。表明MTH1745的表達(dá)與溫度相關(guān),當(dāng)偏離最適生長(zhǎng)溫度時(shí)MTH1745 mRNA表達(dá)上調(diào)以幫助體內(nèi)蛋白質(zhì)正確折疊。 為了研究MTH1745的功能,成功地構(gòu)建了E.coli(pET-28a-MTH1745)活性檢測(cè)系統(tǒng),MTH1745在51℃熱脅迫60min能夠提高脅迫后細(xì)胞的生存率23%。這一結(jié)果表明MTH1745對(duì)細(xì)胞受到熱損傷后起到重要的保護(hù)作用。 本研究運(yùn)用分子生物和生物化學(xué)技術(shù)全面地分析了MTH1745的還原酶,二硫鍵異構(gòu)酶和分子伴侶活性。通過(guò)胰島素混濁度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MTH1745蛋白的還原酶活性,表明MTH1745具有還原酶活性。MTH1745復(fù)性還原變性RNase A分析,表明MTH1745具有二硫鍵異構(gòu)活性,其活力相當(dāng)于人PDI的28%。在43℃MTH1745減少熱誘發(fā)的檸檬酸合成酶的聚集23%,具有分子伴侶活性。 為進(jìn)一步確定MTH1745的二硫鍵異構(gòu)酶活性,本研究進(jìn)行了MTH1745對(duì)DsbA的互補(bǔ)分析。結(jié)果顯示菌株JCB573,JCB579,JCB580和JCB581分別回復(fù)了AP活性的19.81%,37.98%,26.34%和36.07%,表明MTH1745可部分功能互補(bǔ)大腸桿菌DsbA。 所有分析顯示,MTH1745能幫助嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌抵抗不適環(huán)境的變化,具有二硫鍵異構(gòu)酶所共有的酶活特征(還原酶、二硫鍵異構(gòu)和分子伴侶活性)。研究嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌的二硫鍵異構(gòu)酶有助于認(rèn)識(shí)古菌的抗脅迫機(jī)制,有助于了解二硫鍵異構(gòu)酶的系統(tǒng)發(fā)育,為生命的起源和進(jìn)化提供更多的線索。 【關(guān)鍵詞】：古菌 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌 脅迫 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 分子伴侶
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：Q93
【目錄】：

• 目錄4-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-36
• 1 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌12-17
• 2 蛋白質(zhì)折疊17-21
• 3 二硫鍵異構(gòu)酶21-31
• 3.1 真核蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶PDI22-29
• 3.2 大腸桿菌Dsb C29-31
• 3.3 古菌的二硫鍵氧化還原酶31
• 4 本研究的目的和內(nèi)容31-32
• 5 參考文獻(xiàn)32-36
• 第二章 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌DX01的分離純化和特征研究36-55
• 1 引言36-37
• 2 材料37-38
• 2.1 試驗(yàn)材料37
• 2.2 主要試劑37-38
• 2.3 主要儀器38
• 3 方法38-45
• 3.1 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌的分離純——Hungate技術(shù)38-39
• 3.2 102G氣相色譜儀的參數(shù)39
• 3.3 透射式電子顯微鏡觀察39
• 3.4 嗜熱自養(yǎng)甲烷菌DNA的提取39-40
• 3.5 16S rDNA的克隆40-41
• 3.6 G+C mol%的測(cè)定41-42
• 3.7 DNA-DNA雜交42-43
• 3.8 PCR介導(dǎo)的DNA指紋圖譜分析(PCR Melting Profiles)43-45
• 3.9 SDS-PAGE45
• 3.10 蛋白質(zhì)N末端測(cè)序45
• 3.11 甲基輔酶M還原酶I的克隆45
• 4 結(jié)果45-53
• 4.1 M.thermoautotrophicus DX01的形態(tài)特征和生理生化分析45-51
• 4.2 M.thermoautotrophicus DX01抗脅迫蛋白質(zhì)的分離與純化51-53
• 5 討論53-54
• 6 參考文獻(xiàn)54-55
• 第三章 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)的表達(dá)特征研究55-66
• 1 引言55-56
• 2 材料56
• 1.1 試驗(yàn)材料56
• 1.2 主要試劑56
• 1.3 主要儀器56
• 3 方法56-61
• 3.1 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH~T的培養(yǎng)——Hungate技術(shù)56-57
• 3.2 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH~T在不同溫度的培養(yǎng)和冷激處理57
• 3.3 RNA的提取57-58
• 3.4 反轉(zhuǎn)錄(RT)58
• 3.5 Real-time PCR58-61
• 3.5.1 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH~T 16S rDNA的TA克隆58-60
• 3.5.2 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)的TA克隆60
• 3.5.3 定量PCR60-61
• 4 結(jié)果61-64
• 4.1 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因ORF的克隆61
• 4.2 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因ORF和16S rDNA部分片段的克隆61-62
• 4.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)mRNA表達(dá)的影響62-63
• 4.4 冷激處理對(duì)二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)mRNA表達(dá)的影響63-64
• 5 討論64-65
• 6 參考文獻(xiàn)65-66
• 第四章 MTH1745對(duì)大腸桿菌熱耐受性影響和過(guò)表達(dá)體系的構(gòu)建66-81
• 1 引言66-67
• 2 材料67-68
• 2.1 試驗(yàn)材料67
• 2.2 主要試劑67
• 2.3 主要儀器67-68
• 3 方法68-74
• 3.1 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因編碼區(qū)的克隆68-69
• 3.2 pET-28a(+)—MTH1745原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建69-71
• 3.3 E.coli BL21(DE3)熱耐受性實(shí)驗(yàn)71
• 3.4 E.coli(pSJS1240,pET-28a-MTH1745)過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建71-72
• 3.5 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因表達(dá)產(chǎn)物的Ni柱純化72-73
• 3.6 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因表達(dá)產(chǎn)物的透析復(fù)性73
• 3.7 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定73
• 3.8 HPLC檢測(cè)蛋白質(zhì)純度73-74
• 4 結(jié)果74-78
• 4.1 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)編碼區(qū)的克隆和pET-28a(+)-MTH1745原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建74
• 4.2 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)74-75
• 4.3 誘導(dǎo)表達(dá)和E.coli BL21(DE3)熱耐受性75-76
• 4.4 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因原核表達(dá)產(chǎn)物胞內(nèi)存在形式的鑒定76-77
• 4.5 SDS-PAGE檢測(cè)純化復(fù)性后二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)蛋白質(zhì)77
• 4.6 HPLC檢測(cè)純化的二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)蛋白質(zhì)77-78
• 5 討論78-79
• 6 參考文獻(xiàn)79-81
• 第五章 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)的體外活性檢測(cè)與分析81-90
• 1 引言81-82
• 2 材料82-83
• 2.1 試驗(yàn)材料82
• 2.2 主要試劑82
• 2.3 主要儀器82-83
• 3 方法83-85
• 3.1 還原酶的測(cè)定83
• 3.2 二硫鍵異構(gòu)活性的測(cè)定83-84
• 3.3 分子伴侶活性的測(cè)定84-85
• 4 結(jié)果85-86
• 4.1 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)的還原酶活性85
• 4.2 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)的二硫鍵異構(gòu)活性85-86
• 4.3 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)的分子伴侶活性86
• 5 討論86-87
• 6 參考文獻(xiàn)87-90
• 第六章 二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)對(duì)大腸桿菌DSBA的互補(bǔ)分析90-106
• 1 引言90-91
• 2 材料91
• 2.1 試驗(yàn)材料91
• 2.2 主要試劑91
• 2.3 主要儀器91
• 3 方法91-101
• 3.1 構(gòu)建質(zhì)粒pFK19891-95
• 3.2 pFK200的構(gòu)建95-100
• 3.3 JCB573,JCB579,JCB280,JCB583的構(gòu)建100
• 3.4 堿性磷酸酶(AP)活性的檢測(cè)100-101
• 4 結(jié)果101-104
• 4.1 嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌二硫鍵異構(gòu)酶(MTH1745)基因編碼區(qū)的克隆101
• 4.2 pFK198質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定101-102
• 4.3 Apss,MTH1745和Apss-MTH1745的克隆102-103
• 4.4 pFK200質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定103
• 4.5 AP酶活性檢測(cè)103-104
• 5 討論104-105
• 6 參考文獻(xiàn)105-106
• 第七章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望106-108
• 1 結(jié)論106-107
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)107
• 3 有待進(jìn)一步開展的工作107-108
• 附錄108-116
• 附錄一 常用試劑的配置108-112
• 附錄二 本論文所用菌株和質(zhì)粒一覽表112-113
• 附錄三 本論文所用引物一覽表113-114
• 附錄四 縮略詞表114-115
• 附錄五 攻讀研究生期間發(fā)表、投稿的論文115-116
• 致謝116

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