生物技術(shù)工程 論文

【專家解說】：基因工程制藥------淺談 摘要： 主要介紹基因工程的概念、基因工程技術(shù)開發(fā)藥物的一般過程及基因工程藥物，同時探討了今后利用基因工程技術(shù)進行藥物開發(fā)、研究的發(fā)展方向。 正文： 1 基因工程概述 所謂的基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。 基因工程的第一個重要特征是跨越天然物種屏障的能力，即把來自任何一種生物的基因放置在與其毫無親緣關(guān)系的新寄主生物細胞中去的能力。這表明人們有可能按照主觀愿望創(chuàng)造出自然界中不存在的新物種。第二個特征是，它強調(diào)了一種確定的DNA小片段在新寄主細胞中進行擴增的事實．才能制備到大是純化的DNA片斷，從而拓寬了分子生物學(xué)的領(lǐng)域，使之在生物制藥領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用。 基因工程自從20世紀70年代初期問世以來，無論是在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域，還是在生產(chǎn)實際應(yīng)用方面．都已經(jīng)取得了驚人的成績?；蚪M核苷酸全序列的測定與分析，是基因工程技術(shù)促進基礎(chǔ)生物學(xué)研究的一個出色范例。2001年2月12 日，由6國的科學(xué)家共同參與的國際人類基因組公布了人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果，這結(jié)果為人們提供了約3000 多個基因可用來制藥，將推進基因制藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。由于基因克隆技術(shù)的發(fā)展，已使得基因工程技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)尤其是制藥生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。以前人們利用微生物自身生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，如利用青霉菌生產(chǎn)青霉素、利用鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素等。但是從這些生物體中分離純化這些藥物，不僅成本昂貴，而且技術(shù)上也相當困難。如今將編碼這些藥物的基因克隆并轉(zhuǎn)移到合適的生物體內(nèi)進行有效的表達，就可以方便地提取到大量的有用藥物。 2 基因工程技術(shù)開發(fā)藥物的一般過程 利用基因工程技術(shù)開發(fā)一個藥物，一般要經(jīng)過以下幾個步驟：①目的基因片斷的獲得：可以通過化學(xué)合成的方法來合成已知核苷酸序列的DNA片段；也可以通過從生物組織細胞中提取分離得到，對于真核生物則需要建立cDNA文庫。 ②將獲得的目的基因片斷擴增后與適當?shù)妮d體連接后，再導(dǎo)入適當?shù)谋磉_系統(tǒng)。③在適宜的培養(yǎng)條件下，使目的基因在表達系統(tǒng)中大量表達目的藥物。④將目的藥物提取、分離、純化，然后制成相應(yīng)的制劑。 以上方法大部分是以微生物或組織細胞作為表達系統(tǒng)．通過微生物發(fā)酵或組織細胞培養(yǎng)來進行藥物生產(chǎn)。近年來，通過轉(zhuǎn)基因動物來進行藥物生產(chǎn)的"生物藥廠"成為目前轉(zhuǎn)基因動物研究的最活躍的領(lǐng)域，也是基因工程制藥中最富有誘人前景的行業(yè)。轉(zhuǎn)基因動物制藥具有生產(chǎn)成本低、投資周期短、表達量高、與天然產(chǎn)物完全一致、容易分離純化等優(yōu)勢，尤其是適合于一些用量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的血液因子，如人血紅蛋白（Hb）、人血白蛋白（HSA）、蛋白C（Protein C）等。英國的愛丁堡制藥公司通過轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)α1-抗胰蛋白酶（α1-AAT）用于治療肺氣腫，每升羊奶中產(chǎn)16g AAT，占奶蛋白含量的 30%，估計每只泌乳期母羊可產(chǎn)70g AAT。另外，轉(zhuǎn)基因植物制藥比轉(zhuǎn)基因動物制藥更為安全，因為后者有可能污染人類的病原體。目前，已經(jīng)開發(fā)出許多轉(zhuǎn)基因植物藥物，例如腦啡肽、α-干擾素和人血清蛋白，以及兩種最昂貴的藥物即葡萄糖腦苷脂酶和粒細胞-巨噬細胞群集落因子等。 3 基因工程藥物 基因工程藥物自20世紀70年代末期以來，有了飛躍的發(fā)展。1978年首次通過大腸桿菌生產(chǎn)由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素，1980年美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以獲得專利．1982年第一個由基因工程菌生產(chǎn)的藥物--胰島素．在美國和英國獲準使用以來，各種基因工程藥物猶如雨后春筍，得到了蓬勃發(fā)展。我國的醫(yī)藥技術(shù)的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化也取得了長足的進展。 （1） 抗生素類 傳統(tǒng)的抗生素生產(chǎn)，主要利用化學(xué)合成或微生物發(fā)酵來獲得，其生產(chǎn)過程中菌種的表達水平比較低，生產(chǎn)成本比較高，而且在使用過程中容易產(chǎn)生耐藥菌群。而利用基因工程技術(shù)可以對生產(chǎn)菌種進行基因改造，得到表達水平高、產(chǎn)品目的性強的菌株，如大腸桿菌生產(chǎn)青霉素酞胺酶。德國一個科研小組對生產(chǎn)半合成青霉素的材料6APA．用基因工程來增強大腸桿菌的青霉素酰胺酶活性。將大腸桿菌的基因 PBR322的質(zhì)粒克隆化所形成的菌株，其酶活力比原株提高 50倍．從而提高6APA生產(chǎn)能力。我國王以光利用基因重組技術(shù)對螺旋霉素產(chǎn)生菌進行改造，增強了丙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因在螺旋霉素產(chǎn)生菌中的表達，并提高了丙酰螺旋霉素的產(chǎn)量。 （2） 活性多肽類 在人體中存在一系列含量較低，但生理活性很高，而且在人體代謝過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用的活性多肽類物質(zhì)如激素等，這些物質(zhì)在臨床上可以作為藥物來治療相應(yīng)的因此類物質(zhì)失衡而造成的疾病。此類藥物的制劑多來源于各種動物的臟器，生產(chǎn)方法復(fù)雜，成本高，個別產(chǎn)品還必須從動物的尸體中進行提取，無法進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，自基因工程技術(shù)問世以來，通過基因重組技術(shù)，可以由微生動進行生產(chǎn)，這是基因工程技術(shù)的最大成就之一，以下是這類藥物中比較典型的兩個。 胰島素： Genentech公司在1978年，由Goeddel等學(xué)者應(yīng)用基因重組技術(shù)開發(fā)出使用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，生產(chǎn)胰島素的工藝和技術(shù)也不斷得到完善，在臨床上已經(jīng)完全取代了由動物臟器提取得到的產(chǎn)品。目前，我國新疆轉(zhuǎn)基因羊已能夠成功表達人胰島素原，為胰島素的生產(chǎn)開發(fā)了新途徑。 生長素： 人類生長素臨床用于治療侏儒癥和肌肉萎縮癥．傳統(tǒng)制造方法是由人腦下垂體抽提精制而得，其原料來源困難，產(chǎn)量受到極大限制。全世界侏儒癥患者中僅有1%可以得到治療，原因是生長素價格極其昂貴，達每克5000美元。1979年Genentech公司由Goeddel等學(xué)者應(yīng)用基因重組技術(shù)首先開發(fā)出使用大腸桿菌生產(chǎn)人生長素．近年來還開發(fā)了以酵母菌來生產(chǎn)生長素，其產(chǎn)量可達到1.4×106～4.7× 106分子/細胞。目前，我國基因工程人生長素已研制成功，并投入市場和用于臨床使用。 除上述藥物外，運用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的這類藥物還有神經(jīng)生長因子（PDGH）、人基底成纖維細胞生長因子、絨毛膜促性腺激素等。 （3） 細胞免疫調(diào)節(jié)因子 基因工程技術(shù)用于細胞免疫調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)品較多，臨床廣泛應(yīng)用于抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等。近年來，由于基因重組和細胞融合兩大技術(shù)的進步，加上高壓液相層析技術(shù)、氨基酸序列分拆裝置以及蛋白質(zhì)的精制和解析技術(shù)的改進，使一些調(diào)節(jié)細胞免疫活性物質(zhì)的研究和開發(fā)得到快速發(fā)展，如干擾素（INF）、白介素（IL）、集落刺激因子（CSF）和腫瘤壞死因子（TNF）等。 干擾素是其中研究較為廣泛，技術(shù)比較成熟，產(chǎn)業(yè)化較早的一個產(chǎn)品。第一代干擾素是從血液中進行提取而得到。據(jù)芬蘭的K Canted報道，處理23000L血液，所得純度1%以下的干擾素不足100mg．所以產(chǎn)量很低。而且由于血源質(zhì)量不能保證，可能造成血源性傳染病的傳播。第二代干擾素是采用基因工程技術(shù)進行生產(chǎn)的，其生產(chǎn)水平可達250000分子/細胞，每升可含2.5億單位，成本顯著下降，產(chǎn)品純度很高，含量可達90%以上。目前，已經(jīng)商品化的基因工程干擾素有α、 β、γ三種，而且生產(chǎn)技術(shù)也在不斷完善。俄羅斯科學(xué)家構(gòu)建了以假單胞菌為載體的表達系統(tǒng)來生產(chǎn)基因工程干擾素．與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)相比其培養(yǎng)周期短，細胞易于破碎便于提取。隨著基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展，一些研究人員對干擾素基因進行改造，構(gòu)建靶向干擾素基因及表達載體。夏小兵等利用限制性內(nèi)切酶分別從含有抗乙型肝炎S抗原（HbSAg）人源單鏈抗體與人干擾素α質(zhì)粒中切出目的基因，連接到 pET22b質(zhì)粒中，構(gòu)建成單鏈抗體靶向干擾素表達載體，在大腸桿菌中表達成功。 （4） 疫苗傳統(tǒng)的疫苗是病源微生物的減毒或滅活物質(zhì)，但這些疫苗都不理想，有可能發(fā)生回復(fù)突變，恢復(fù)毒性；或者因為滅活不適當引起疾病流行。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的新型疫苗，可以克服傳統(tǒng)疫苗價格昂貴、安全性能差等缺點，能為目前尚無有效疫苗的某些特殊疾病如艾滋病，提供有效的治療手段。 第一個商品化的基因工程疫苗是抗人乙型肝炎病毒（HBV）的疫苗。我國大約有10% 的人口受到HBV的侵害， HBV的感染通常還與特殊的肝癌（HCC）有著密切的關(guān)系，每年全世界死于HCC的病人有30萬左右。HBV具有高度的寄主專一性，只能感染人類和黑猩猩，這意味著只能從肝炎患者身上才能獲得有限數(shù)量的病毒，供做疫苗使用，而且從患者血液中提取制備的疫苗，還有傳染艾滋病的可能。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的抗HBV疫苗克服了傳統(tǒng)疫苗的缺點，質(zhì)量和安全性高，用量極少，一般劑量為10mg以下，接種3次，為普通藥品用量的千分之一。1982年P(guān) Valenzuela等人將S基因（HBV表面抗原基因）的一個片段克隆在一種載體上，結(jié)果在酵母中合成出來HBV表面抗原（HbsAg）顆粒，其產(chǎn)量達25 μg/L，酵母表達系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)能夠大規(guī)模生產(chǎn)供給人類使用的重組肝炎疫苗。 大約20年前，人們發(fā)現(xiàn)"裸露"DNA注入體內(nèi)能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)，科學(xué)家們進行了大量研究，開發(fā)出了新型的核酸疫苗。所謂核酸疫苗，是指將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，通過宿主表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主對該抗原蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的?，F(xiàn)已開發(fā)出多種核酸疫苗，例如：流感核酸疫苗、艾滋病疫苗、狂犬病疫苗、結(jié)核病疫苗和乙型肝炎疫苗和戊肝疫苗等。 （5） 基因治療制品 基因治療在1990年開始進行實驗， 1993年美國FDA給人類基因治療下的定義為："基于對活性細胞遺傳物質(zhì)的改變而進行的醫(yī)學(xué)治療，這種改變可以在活體外進行，然后應(yīng)用于人體，或者直接在人體內(nèi)進行"。因此，基因治療存在兩種方式，即間接體內(nèi)法和體內(nèi)法。間接體內(nèi)法主要是通過在體外進行基因轉(zhuǎn)移，篩選可表達外源基因的細胞，然后再轉(zhuǎn)移到體內(nèi)；體內(nèi)法則是直接在體內(nèi)改變與修復(fù)遺傳物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)、基因重組技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)目的基因的獲得方法已趨成熟，但是，目的基因的轉(zhuǎn)移傳遞系統(tǒng)、目的基因的表達調(diào)控以及療效和安全性還需進一步研究證實。目前，基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要是兩類：一類是由病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、皰疹病毒（HSV）和腺病毒相關(guān)病毒（AAV）載體等。Nnldini等開發(fā)出一種基于HIV的重組Rt載體，不需要輔助細胞，能廣泛感染各種非分裂細胞，同時保留了能整合在宿主染色體上的特點。世界上第一例基因治療所采用的載體即是Rt載體，治療腺苷酸脫羧酶缺乏所致的嚴重聯(lián)合免疫缺乏癥（ADA-SCID）。另外一類是非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體、分子偶聯(lián)載體、基因槍和裸DNA等。 另外，反義核苷酸技術(shù)也應(yīng)用于基因治療，尤其在抗乙肝病毒的基因治療方面，包括反義DNA、反義RNA和核酶 RNA等。2001年，Robaczewska等首次通過靜脈給予反義 DNA，選擇性抑制北京鴨HBV在鴨肝臟中的復(fù)制和表達，證明了反義DNA在動物實驗中的有效性。美國Viagene公司研究出一種被稱為"艾滋病毒免疫制劑"，該藥為一種鼠逆病毒與核心蛋白編碼的基因序列和HIV表面抗原RNA結(jié)合產(chǎn)物，在小鼠和靈長類動物試驗中確定該藥能誘導(dǎo)出強的 HIV-特異性殺傷細胞。 4 結(jié)束語 基因工程技術(shù)使藥品開發(fā)發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的藥品開發(fā)方式是在大量的化學(xué)合成物質(zhì)和微生物代謝產(chǎn)物中進行隨機篩選，得到其中的有效成分作為新的藥物。采用基因工程技術(shù)開發(fā)新藥，是通過對致病機理的研究，找到那些可用于治療目的的有效成分以及其編碼基因，經(jīng)過基因重組將其轉(zhuǎn)入適當?shù)妮d體，大量表達其有效成分作為治療藥物。同時，基因工程技術(shù)給藥品生產(chǎn)技術(shù)帶來了革命性變化。過去一些生產(chǎn)困難的產(chǎn)品，如激素、酶、抗體等一些生物活性物質(zhì)，通過基因工程手段可以高質(zhì)量、高收率地付諸生產(chǎn)，同時生產(chǎn)成本也大幅度降低，提高了患者的用藥水平和生活質(zhì)量。 基因工程技術(shù)在傳統(tǒng)醫(yī)藥不能有效治療的一些疾病，如癌癥、艾滋病、遺傳病等的診斷、治療和預(yù)防等方面提供了有效的新手段，并取得了一些重大的突破。如發(fā)現(xiàn)了致癌基因，可使癌癥的早期診斷和治療藥物的開發(fā)成為可能。隨著分子生物學(xué)和基因重組技術(shù)的發(fā)展，我們相信這些嚴重危害人類生命的疾病，在不久的將來會得到有效的預(yù)防和治療。