培養(yǎng)微生物時都需提供生長因子嗎?

【專家解說】：需要 以下是我?guī)湍悴榈囊粍t資料希望對你有幫助 組織培養(yǎng)(Tissue culture)是在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下。使從體內(nèi)取出的組織生存、生長繁殖和傳代，并維持原有的結(jié)構(gòu)和功能特性。廣義的組織培養(yǎng)與體外培養(yǎng)同義。體外培養(yǎng)(Invitro)包括所有結(jié)構(gòu)層次的培養(yǎng)，即:組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。 所謂細(xì)胞培養(yǎng)(Cell culture)是指細(xì)胞包括單個細(xì)胞在體外條件的生長。 組織培養(yǎng)的發(fā)展史已有近百年，最初的組織培養(yǎng)是胚胎學(xué)和微生物學(xué)的引申，建立于無菌原則上，用天然體液(如胎汁、血漿)來維持從整體切下的組織塊，對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)和功能的觀察。 通過許多學(xué)者大的改進(jìn)和革新，培養(yǎng)基由天然動物血漿改為合成培養(yǎng)基，促進(jìn)細(xì)胞生長物質(zhì)從胎汁改為動物血清?，F(xiàn)在全世界貯存的細(xì)胞約有萬種以上。組織培養(yǎng)不僅是細(xì)胞生物學(xué)必需的技術(shù)，也是分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科必要的方法。 二.基本原理和方法 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件: (一)營養(yǎng)。 體外培養(yǎng)細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)相同，主要有糖、氨基酸和維生素三大類。目前市面上銷售的合成培養(yǎng)基如1640、199等所含的氨基酸已足夠，但在使用合成培養(yǎng)基時，仍需加入一些天然成份，如人或動物的血清、血漿和胎汁等。目前主要使用血清，以牛血清為主。血清的生物效應(yīng)早已證明，它含有多種促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其它活性物質(zhì)等。不僅能促進(jìn)細(xì)胞增長且能幫助細(xì)胞貼壁。不同血清對細(xì)胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和馬血清次之。合成培養(yǎng)基中不加血清也能維持細(xì)胞生存，但不能很好生長，加入5%的血清，對大多數(shù)細(xì)胞來說，能維持細(xì)胞不死和緩慢生長，要使細(xì)胞正常生長，一般需加10~15%的小牛血清。每個批號血清使用前要加熱處理，一般滅活于56℃水浴中30分鐘，每個批號血清使用前要加熱處理，一般滅活于56℃水浴中30分鐘，每5分鐘搖一次。10%血清營養(yǎng)液能促進(jìn)細(xì)胞增殖稱為生長液，2~5%血清培養(yǎng)液不能使細(xì)胞增殖而只能維持其生存稱為維持液。添加血清，雖利于細(xì)胞生長，但增加了不明成分，給分析實驗結(jié)果帶來了困難。因此，人們正在探索不用血清的無血清液并已取得了一定進(jìn)展。 (二)環(huán)境 1.無菌:無菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。培養(yǎng)液不僅對細(xì)胞是高營養(yǎng)物，對細(xì)菌和霉菌也是高度營養(yǎng)物，細(xì)胞培養(yǎng)中如污染微生物，其繁殖比細(xì)胞快且能產(chǎn)生毒素使細(xì)胞死亡，因此細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵之一是防止污染。污染微生物可來源于組織培養(yǎng)液、器皿、組織本身、工作者本身。因此，培養(yǎng)室的空氣等要徹底消毒，所有操作均要嚴(yán)格實行無菌操作，各種物品拿入操作臺前應(yīng)消毒，用灑精擦表面，用前于紫外線照;操作者洗手、泡手，酒精擦手，打開培養(yǎng)管前須在火焰上烙燒一下瓶口以使灰塵固定，操作時須將瓶、管斜放，吸管注入液體應(yīng)避免和瓶口接觸，操作時禁止講話。 2.溫度:組織培養(yǎng)的最適溫度為35-37℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比高溫強(qiáng)。溫度增加2-3℃對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，使之在24小時死亡，溫度在43℃以上，細(xì)胞大多被殺滅，而低溫對細(xì)胞影響較小，細(xì)胞置于25-35℃時，細(xì)胞仍能生存和生長，但速度緩慢，放在4℃數(shù)小時之后，再置37℃培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長。 3.氣體:氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一。所需的氣體主要有O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種成分。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物也是細(xì)胞所需成分。它主要與維持培養(yǎng)液pH值有直接關(guān)系。 4.pH值:多數(shù)細(xì)胞的適宜pH值為7.0-7.4，偏離此范圍對細(xì)胞可產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對pH值的要求也不完全相同，但總的來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽/ CO2。細(xì)胞代謝產(chǎn)生的各種酸使pH下降，而培養(yǎng)液中的NaHCO3產(chǎn)生CO2排入空間又使pH增加。 5.培養(yǎng)器皿的處理:培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對于細(xì)胞的貼壁生長影響很大，除少數(shù)懸浮生長的細(xì)胞外，絕大多數(shù)細(xì)胞屬于貼壁依賴性細(xì)胞或培養(yǎng)物。它們只有貼附于不起化學(xué)作用的物體的表面時，才能生長、生存或維持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡1至7天，清水沖洗20次后再用蒸餾水過洗2次，烤干備用。用前160℃高溫消毒2小時后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小時后，清水洗凈再用1N HCL浸泡4小時，用清水沖洗后再用蒸餾水漂洗，37℃干燥后，紫外線燈照射消毒;新橡皮塞須先用1/2NnaOH煮沸15分鐘，沖洗后再用4%HCL煮沸15分鐘，清水沖洗后用蒸餾水洗5次，煮沸10分鐘滅菌，或送高壓滅菌。 總之，細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可迅速增殖，但若遇到不良環(huán)境細(xì)胞會變圓，停止生長，甚至死亡，這是細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。綜上所述，細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件主要包括了營養(yǎng)液、無菌條件、PH、溫度、氣體條件和培養(yǎng)器皿的清潔度。 三.常用的培養(yǎng)方法 根據(jù)培養(yǎng)物細(xì)胞生物學(xué)的特點，組織培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。亦可根據(jù)培養(yǎng)條件和器皿的不同而分為靜置培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)為最常見的方式，細(xì)胞可為貼壁型細(xì)胞，亦可為懸浮的不貼壁細(xì)胞。 (一) 傳代細(xì)胞的靜置培養(yǎng) 我室現(xiàn)存的細(xì)胞均為傳代細(xì)胞，CNE-2Z是我們80年代從一鼻咽癌病人取組織經(jīng)過體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、連續(xù)傳代，生長穩(wěn)定，并經(jīng)過一系列的生長特性檢測(如生長曲線、分裂指數(shù)、細(xì)胞群體倍增時間、集落形成率)、染色體分析、異體移植、電鏡觀察等而建立的，并于83年榮獲省高教廳及衛(wèi)生廳科研成果一等獎，84年衛(wèi)生部科研成果乙等獎。建系20年來，CNE-2Z已在全世界廣泛應(yīng)用，我室也仍有保存和應(yīng)用。 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和傳代:所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括原代培養(yǎng)和各種細(xì)胞系(株)，當(dāng)生長達(dá)到一定的密度后，都需要做傳代處理。傳代的頻率和間隔與接種細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞生物學(xué)特性以及營養(yǎng)性質(zhì)等有關(guān)。接種細(xì)胞多則細(xì)胞數(shù)飽和速度快;腫瘤細(xì)胞系比原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時，細(xì)胞增殖快。一般是在細(xì)胞長滿瓶壁、營養(yǎng)及PH稍降低時做傳代培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞特性，將一瓶細(xì)胞1:3或1:4傳代。在細(xì)胞長滿時，應(yīng)盡早傳代，否則細(xì)胞會中毒，形態(tài)發(fā)生改變，重則從壁上脫落死亡。傳代過晚(若已有中毒跡象)能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)，細(xì)胞需要再傳一兩代，把不健康的細(xì)胞除去，才能恢復(fù)使用。那么，怎樣才能做到及時傳代呢?要做到及時傳代，每天要仔細(xì)觀察細(xì)胞的生長情況來決定是否要換液或傳代。一般是形態(tài)觀察，用倒置顯微鏡對活細(xì)胞形態(tài)、胞漿和胞膜進(jìn)行觀察。生長狀態(tài)良好的細(xì)胞透明度大，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，看不見空泡，胞膜清晰，折光性強(qiáng)。培養(yǎng)上清液清晰透明，看不見懸浮的細(xì)胞和碎片。細(xì)胞機(jī)能不良時，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴和其它顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則，甚至失去原有的特點。只有狀態(tài)良好的細(xì)胞才能用來做實驗。一般在細(xì)胞接種或傳代后，每天或至多間隔1-2天，應(yīng)觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長、培養(yǎng)液PH值和污染與否等，隨時掌握細(xì)胞動態(tài)變化，以便于做換液或傳代處理。如發(fā)現(xiàn)異常情況，及時采取措施。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色，用一般溫箱培養(yǎng)時，隨細(xì)胞生長時間的延長，二氧化碳積累增多，由于培養(yǎng)基內(nèi)有PH指示劑的存在，其顏色可間接反映細(xì)胞的生長狀態(tài)。呈橙黃色時，細(xì)胞一般生長狀態(tài)較好;呈淡黃色則可能是培養(yǎng)時間過長，營養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞過多;呈紫紅色則可能是細(xì)胞生長狀態(tài)不好或已死亡。 (二) 培養(yǎng)細(xì)胞的保存和復(fù)蘇 做實驗前要先學(xué)會凍存，以備自己在后面的實驗中能保持同一來源、穩(wěn)定可靠的細(xì)胞，且可減少污染或其它不利影響。 1.影響凍存細(xì)胞活性的因素 (1)細(xì)胞凍存保護(hù)劑:常用的有二甲基亞砜(DMSO)和甘油，常用的濃度為5%-10%(90%小牛血清)。DMSO對二倍體細(xì)胞的毒性較甘油小。 (2)細(xì)胞懸液的凍結(jié)速度:慢凍時冰凍在細(xì)胞外形成，因此不致?lián)p害細(xì)胞。多數(shù)細(xì)胞以每分鐘下降1℃的速度，降至-20℃凍結(jié)。均可獲得滿意效果。 (3)保存溫度:液氮罐，可達(dá)到-196℃，此時所有的物理化學(xué)活動均降至最低限度，以保證細(xì)胞長期保存。 (4)復(fù)蘇:急速融化復(fù)蘇可防止損害細(xì)胞。凍結(jié)細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃~43℃的水浴中，30秒至一分鐘內(nèi)融化。 2.凍存與復(fù)蘇方法 適用于原始組織、原代細(xì)胞和細(xì)胞系(株)。A.細(xì)胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用凍存液稀至2~5X106/ml。B.分裝于2ml凍存管中，裝量1ml，封口，作好標(biāo)記，用幾層紗布扎好。C.凍存管進(jìn)入液氮前應(yīng)有一個漸降溫的過程，以1℃/min的速度降溫，一般掛在液氮上空8小時后，投入液氮貯存罐中長期保存。D.為使凍存的細(xì)胞復(fù)蘇，將凍存管置于37℃~43℃水浴中，充分搖動使其急速融化，30秒至1分鐘內(nèi)完成。E.細(xì)胞懸液低速離心，去除上清中的保護(hù)添加劑，加入原來使用的生長液，置37℃培養(yǎng)。 四.基本設(shè)備和試劑 設(shè)備(略)，環(huán)境要求清潔、空氣干燥和無煙塵。 基本試劑 培養(yǎng)液:①1640溶于新蒸的三次蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，過濾除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分鐘滅活(破壞補(bǔ)體)分裝置-20℃保存?zhèn)溆?。③青鏈雙抗液將100萬單位的青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素用高壓2次后的三蒸水100ml充分溶解，分裝凍存于-20℃，使用前融化，每100ml生長液中加1ml，即使用終濃度為含P.S 100μg/ml。(注:P.S不能凍融多次，應(yīng)少量分裝，一次用完)。④NaHCO3液，用于調(diào)整pH值，常用濃度為5~6%，配制用三蒸水溶解后過濾除菌或高壓滅菌，分裝4℃保存。⑤胰蛋白酶 在pH 8.0，溫度37℃時作用力最強(qiáng)(詳見配方)。⑥EDTA液(詳見配方)。 附: 胰酶消化液配方(500ml) NaCL 4 g KCL(19%) 1 ml Na2HPO4 0.126g(12H2O) Tris 1.5g(三羥甲基氨基甲烷) 以上藥物充分溶解后加水至500 ml，然后再加胰蛋白酶5g，最后用1N HCL調(diào)pH至7.7，過濾除菌分裝，然后-20℃保存?zhèn)溆谩? EDTA液配方(0.2% 1000ml) EDTA(versene) 2 g NaCL 8 g KCL 0.2g Na2HPO4(12H2O) 2.9g KH2PO4 0.2g 以上藥物同樣充分溶解后，加新鮮的三蒸水至1000 ml，分裝然后高壓15磅30分鐘滅菌，最后4℃保存?zhèn)溆谩? 細(xì)胞凍存液:小牛血清90℅與二甲基亞砜(DMSO)10℅混合; -20℃冰箱保存?zhèn)溆??；蛐∨Ｑ?0℅，1640培養(yǎng)液60℅，DMSO10℅混合; - 20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/div>