肺炎病患下呼吸道及沼氣發(fā)酵體系的宏基因組學研究

【摘要】：作為一個新興的研究領域,宏基因組學為微生物研究開拓了新的空間。宏基因組學憑借其高新的技術,已經(jīng)滲透到眾多復雜環(huán)境研究領域,例如海洋、土壤、熱泉、人體口腔及胃腸道、替代能源、環(huán)境修復、農(nóng)業(yè)和生物防御等。正常人體下呼吸道是一個相對封閉的無菌環(huán)境,細菌侵染下呼吸道會對人體健康乃至生命造成極大的威脅。目前人體下呼吸道微生物組研究由于受到取樣方法等問題的限制,研究尚不夠深入。而在人體環(huán)境之外其他封閉環(huán)境中,例如沼氣發(fā)酵體系,宏基因組學研究也尚在起步階段。沼氣發(fā)酵體系宏基因組學研究,可以揭示發(fā)酵體系內(nèi)菌群功能特征,對提高甲烷產(chǎn)氣量、指導工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。 本文針對人體內(nèi)、外環(huán)境分別選取肺炎病患下呼吸道和沼氣發(fā)酵體系為代表,優(yōu)化了不同樣品DNA獲得方法,通過高通量測序和生物信息學手段,分析研究了兩種相對封閉環(huán)境的微生物群落特征,發(fā)現(xiàn)了一些鮮有報道但有重要作用的菌種。 肺炎病患下呼吸道宏基因組學研究中,為避免上呼吸道及口腔菌群的干擾,選取病人的支氣管肺泡灌洗液為樣本,獲得了下呼吸道樣品總DNA。通過反向雜交篩選方法,利用鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)生物素探針,雜交去除人類基因組DNA。經(jīng)過進一步Real-time PCR檢測和454焦磷酸測序,證明經(jīng)過處理的樣本不僅保持了高豐度菌群的群落特征,還對中低豐度菌群有良好的覆蓋。通過生物信息學分析,鑒定了20種呼吸道重癥感染相關細菌物種,發(fā)現(xiàn)了兩種呼吸道潛在致病菌Microbacterium laevaniformans和Borrelia garinii,檢測到4種耐藥基因和6種細菌侵染所需的毒力因子。宏基因組學研究結(jié)果與患者的臨床癥狀相吻合,為快速診斷及合理用藥提供了依據(jù)。 沼氣發(fā)酵體系宏基因組學研究中,比較并優(yōu)化了總DNA的提取方法。利用454焦磷酸測序技術和生物信息分析手段,獲得了厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷體系中微生物群落的整體特征,并發(fā)現(xiàn)不同提取方法中細胞裂解手段與裂解程度對后續(xù)菌群分析有著顯著影響。對菌群分布的研究發(fā)現(xiàn),高豐度菌群主要參與蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素以及其他大分子聚合物降解。通過基因功能注釋檢測到體系內(nèi)存在食乙酸和食氫兩種代謝途徑。本體系中新發(fā)現(xiàn)兩種優(yōu)勢菌屬Psychrobacter和Anaerococcus。其中,Psychrobacter含有低溫脂肪水解酶,在中低溫發(fā)酵應用中具有潛在價值。而Anaerococcus屬在本研究體系中大量存在,也揭示它在生物質(zhì)降解產(chǎn)甲烷過程中的巨大潛能。這些研究結(jié)果,為優(yōu)化中低溫固態(tài)厭氧沼氣發(fā)酵工藝、提高甲烷產(chǎn)氣量提供了依據(jù)。 【關鍵詞】：宏基因組學 焦磷酸測序 反向雜交篩選 生物信息學分析
【學位授予單位】：中國科學院北京基因組研究所
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R563.1;Q78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 專業(yè)詞匯中英文對照表9-10
• 目錄10-12
• 圖目錄12-13
• 表目錄13-14
• 1 引言14-22
• 1.1 宏基因組學概論14-15
• 1.2 宏基因組學研究手段的發(fā)展15-18
• 1.2.1 傳統(tǒng)宏基因組學研究手段15-17
• 1.2.2 高通量測序技術的發(fā)展17-18
• 1.2.3 研究瓶頸與挑戰(zhàn)18
• 1.3 不同研究策略對菌群豐度的影響18-22
• 2 肺炎病患下呼吸道宏基因組學研究22-62
• 2.1 概述22-28
• 2.1.1 呼吸道微生物研究22-23
• 2.1.2 技術路線23-28
• 2.2 材料與方法28-37
• 2.2.1 儀器與試劑28-31
• 2.2.2 模擬樣品測試31-33
• 2.2.3 呼吸道樣本測試33-35
• 2.2.4 呼吸道宏基因組分析35-37
• 2.3 結(jié)果與討論37-58
• 2.3.1 反向雜交篩選效果37-40
• 2.3.2 綜合評價與方法優(yōu)化40-41
• 2.3.3 宏基因組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計41-43
• 2.3.4 下呼吸道菌群結(jié)構43-48
• 2.3.5 菌群生境與致病性48-55
• 2.3.6 毒力因子與耐藥基因注釋與分析55-58
• 2.4 小結(jié)58-62
• 3 沼氣發(fā)酵體系宏基因組學研究62-92
• 3.1 沼氣發(fā)酵體系概述62-64
• 3.2 材料與方法64-71
• 3.2.1 底物采集與人工馴化64-65
• 3.2.2 DNA提取方法比較與優(yōu)化65-68
• 3.2.3 沼氣宏基因組學分析68-71
• 3.3 結(jié)果與討論71-89
• 3.3.1 提取方法結(jié)果差異71-73
• 3.3.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與比較73-75
• 3.3.3 沼氣發(fā)酵體系菌群結(jié)構分析75-80
• 3.3.4 菌群特征80-82
• 3.3.5 產(chǎn)甲烷途徑功能基因分析82-89
• 3.4 小結(jié)89-92
• 4 結(jié)論92-94
• 參考文獻94-108
• 附錄A108-110
• 附圖1 評價體系BAP質(zhì)粒標曲108
• 附圖2 沼氣發(fā)酵體系16SrDNA T-RFLP峰值錐形圖108-109
• 附圖3 沼氣發(fā)酵體系高豐度菌種特性109-110
• 附錄B110-121
• 附表1 痰液樣品測序結(jié)果中檢測到的細菌種類、分布與致病性110-111
• 附表2 Large contigs(大于9kb)注釋信息111-115
• 附表3 參與產(chǎn)甲烷途徑contigs注釋信息115-121
• 附錄C 評價體系BAP質(zhì)粒序列與檢測片段121-122
• 作者簡介及在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果122
• 作者簡歷122
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文與研究成果122
• 已申請的專利122

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