甘肅省農(nóng)村戶用沼氣池及其發(fā)酵原料微生物群落結(jié)構的研究

【摘要】：人類對能源的需求日益增長,傳統(tǒng)的化石能源卻迅速減少,沼氣技術是我國應對農(nóng)村能源危機和環(huán)境污染等問題的有效途徑。沼氣發(fā)酵過程由細菌和產(chǎn)甲烷古菌的互養(yǎng)合作催化完成,微生物群落結(jié)構知識的匱乏直接阻礙了工程和工藝的改進進程,致使農(nóng)村沼氣系統(tǒng)運行效率低、可控性差及“越冬難”等問題難以解決。因此,研究沼氣池及其發(fā)酵原料中微生物群落組成不僅具有理論意義,更具有巨大的經(jīng)濟效益。目前,嗜中溫沼氣池產(chǎn)甲烷菌多樣性已得到廣泛研究,但是對于低溫沼氣池以及發(fā)酵原料中細菌和古菌群落結(jié)構的研究卻很少。本研究利用16S-rDNA克隆文庫的分子生物學方法對甘肅臨夏以豬糞、牛糞為主要發(fā)酵底物的嗜中溫(夏季)和低溫(冬季)農(nóng)村戶用沼氣池及其糞便原料中的微生物群落結(jié)構進行研究。主要研究結(jié)果如下：1.揭示了中、低溫農(nóng)村戶用沼氣池的微生物多樣性和群落結(jié)構。在12個沼氣池中共檢測到353個細菌類群(隸屬于14個門)和20個古菌類群(隸屬于6個屬)；優(yōu)勢類群分別為Methanomicrobiales(古菌)和Firmicutes、Bacteroides、 Proteobacteria(細菌)。結(jié)果表明農(nóng)村戶用沼氣發(fā)酵系統(tǒng)微生物種類非常豐富,細菌多樣性高于古菌。相似性指數(shù)(Jaccard index;細菌：0.15-0.31,古菌：0.01-0.50)和主成分(PCA)的分析結(jié)果說明不同沼氣池的微生物群落結(jié)構和多樣性存在明顯差異。2.分析了低溫與中溫沼氣池、豬糞池與牛糞池產(chǎn)甲烷功能菌群結(jié)構,發(fā)現(xiàn)它們的優(yōu)勢菌群差異顯著。耐寒菌Methanogenium和Methanocorpusculum的豐度在低溫沼氣池中明顯高于嗜中溫沼氣池,而嗜中溫菌屬Methanoplanus的豐度在嗜中溫沼氣池中明顯高于低溫沼氣池；豬糞池中以Methanocorpusculum為絕對優(yōu)勢菌群,而牛糞池的古菌類群分布則較為均勻。3.闡釋了農(nóng)村戶用沼氣池的主要甲烷代謝途徑。各沼氣池優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌群均為氫營養(yǎng)型的甲烷微菌目成員,因此,氫依賴型甲烷合成通路為主要的甲烷代謝途徑。4.了解了單階段農(nóng)村戶用沼氣池中關鍵微生物菌群的相互作用。纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪酸等復雜有機物的降解主要由Firmicutes、Bacteroides等細菌完成,酸化作用主要由Proteobacteria和Synergistetes等類群完成：產(chǎn)甲烷作用主要由Methanomicrobiales成員完成。5.研究了中、低溫條件下豬糞和牛糞的微生物多樣性和群落結(jié)構。4個糞便樣品中共檢測到290個細菌類群(隸屬于11個門)和13個古菌類群(隸屬于5個屬)。優(yōu)勢類群分別為Methanomicrobiales(古菌)和Firmicutes、Bacteroides、 Proteobacteria(細菌)。結(jié)果表明豬糞和牛糞中微生物種類豐富,細菌多樣性高于古菌,豬糞微生物多樣性高于牛糞。Jaccard index(細菌：0.12-0.24,古菌：0.33-0.55)和PCA結(jié)果說明不同糞便的微生物群落結(jié)構和多樣性存在明顯差異。6.系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明豬糞和牛糞中某些細菌類群呈現(xiàn)出相似的溫度(季節(jié))差異性。β-、γ-、δ-、ε-Proteobacteria、Verrucomicrobia、Chloroflexi的類群豐度低溫大于中溫,Firmicutes、Bacteroidetes、Lentisphaerae、Tenericutes的類群豐度中溫大于低溫。7.揭示了沼氣池與其糞便底物微生物群落的相關性。首先,沼氣池的微生物群落主要源于其糞便底物,二者具有相似的群落結(jié)構和相同的優(yōu)勢類群；其次,二者在細菌優(yōu)勢類群Firmicutes、Bacteroides和Proteobacteria的豐度上呈現(xiàn)相反的變化趨勢,且糞便中存在絕對優(yōu)勢類群,沼氣池中優(yōu)勢類群分布則趨于均勻化；再者,糞便中以降解纖維素的Firmicutes為主,沼氣池中降解小分子化合物的Proteobacteria豐度明顯上升,推測沼氣發(fā)酵過程中對小分子化合物的降解比例明顯升高。8.以糞便為主要發(fā)酵底物的農(nóng)村戶用沼氣池有其獨特的發(fā)酵特征。沼氣池糞便底物比重較大故pH較高(7.92-8.26),池內(nèi)溫度(30-40℃)隨環(huán)境溫度呈現(xiàn)一定波動性；由此造成微生物活性降低、群落結(jié)構不穩(wěn)定,發(fā)酵進程減緩,滯留時間延長(70-80天),最終導致產(chǎn)氣不穩(wěn)定產(chǎn)氣量降低等現(xiàn)象。綜上所述,本研究首次較全面的闡述了以豬糞、牛糞為主要底物的嗜中溫和低溫農(nóng)村戶用沼氣池及其發(fā)酵原料中的微生物群落結(jié)構和多樣性,揭示了沼氣池與其發(fā)酵原料菌群結(jié)構的相關性,初步分析了沼氣發(fā)酵主要功能菌群的相互作用等；為農(nóng)村戶用沼氣發(fā)酵的推廣和高效運行提供一定的理論基礎。 【關鍵詞】：農(nóng)村戶用沼氣池 發(fā)酵底物 微生物多樣性 群落結(jié)構 相互作用
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：S216.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-19
• 1.1 研究背景10-11
• 1.2 沼氣發(fā)酵基礎概述11-13
• 1.2.1 厭氧消化的優(yōu)點11-12
• 1.2.2 沼氣發(fā)酵的基本原理12
• 1.2.3 沼氣發(fā)酵的主要微生物及其相互作用12-13
• 1.3 國內(nèi)外研究進展13-17
• 1.3.1 沼氣發(fā)酵微生物多樣性研究進展13-14
• 1.3.2 微生物分子生物學技術研究進展14-17
• 1.4 研究目的和意義17-19
• 第二章 材料與方法19-24
• 2.1 實驗材料19-20
• 2.2 實驗方法20-24
• 2.2.1 技術路線20-21
• 2.2.2 DNA提取21
• 2.2.3 16S-rDNA擴增、克隆文庫構建及ARDRA分析21-22
• 2.2.4 測序及系統(tǒng)發(fā)育分析22-23
• 2.2.5 統(tǒng)計學分析23-24
• 第三章 結(jié)果24-61
• 3.1 細菌及古菌16S-rDNA基因文庫分析24-26
• 3.1.1 微生物基因組DNA分析24
• 3.1.2 16S-rDNA基因的PCR擴增分析24-25
• 3.1.3 16S-rDNA基因克隆分析25
• 3.1.4 克隆文庫的ARDRA分析25-26
• 3.2 沼氣池細菌群落結(jié)構和多樣性26-38
• 3.2.1 庫容分析26-27
• 3.2.2 細菌16S-rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析27-34
• 3.2.3 不同沼氣池細菌群落結(jié)構比較分析34-36
• 3.2.4 沼氣池細菌多樣性分析36-37
• 3.2.5 沼氣池細菌群落組成的相似性分析37-38
• 3.3 沼氣池古菌群落結(jié)構和多樣性38-45
• 3.3.1 庫容分析38-39
• 3.3.2 古菌16S-rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析39-42
• 3.3.3 不同沼氣池古菌群落結(jié)構比較分析42-44
• 3.3.4 沼氣池古菌多樣性分析44
• 3.3.5 沼氣池古菌群落組成的相似性分析44-45
• 3.4 豬糞和牛糞中細菌群落結(jié)構和多樣性45-54
• 3.4.1 庫容分析45-46
• 3.4.2 細菌16S-rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析46-51
• 3.4.3 豬糞和牛糞細菌群落結(jié)構比較分析51-53
• 3.4.4 豬糞和牛糞細菌多樣性分析53
• 3.4.5 豬糞和牛糞細菌群落組成的相似性分析53-54
• 3.5 豬糞和牛糞中古菌群落結(jié)構和多樣性54-60
• 3.5.1 庫容分析54-55
• 3.5.2 古菌16S-rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析55-57
• 3.5.3 豬糞和牛糞古菌群落結(jié)構比較分析57-58
• 3.5.4 豬糞和牛糞古菌多樣性分析58-59
• 3.5.5 豬糞和牛糞古菌群落組成的相似性分析59-60
• 3.6 沼氣池參數(shù)與微生物群落結(jié)構比較分析60-61
• 第四章 討論61-72
• 4.1 農(nóng)村戶用沼氣池細菌群落結(jié)構分析61-64
• 4.1.1 沼氣池細菌類群代謝特征分析61-63
• 4.1.2 不同沼氣池細菌群落結(jié)構和多樣性比較63-64
• 4.2 農(nóng)村戶用沼氣池古菌群落結(jié)構分析64-68
• 4.2.1 產(chǎn)甲烷菌代謝特征分析64-65
• 4.2.2 不同沼氣池古菌群落結(jié)構和多樣性比較65-66
• 4.2.3 氫依賴型甲烷合成通路為沼氣池中優(yōu)勢甲烷代謝途徑66-68
• 4.3 牛糞和豬糞細菌群落結(jié)構分析68-69
• 4.4 牛糞和豬糞古菌群落結(jié)構分析69
• 4.5 沼氣池與其發(fā)酵底物微生物群落的相關性分析69-70
• 4.6 沼氣池參數(shù)與微生物群落結(jié)構比較分析70-72
• 第五章 結(jié)論72-73
• 參考文獻73-83
• 在讀期間研究成果83-84
• 致謝84-85
• 附錄85-107

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