降解纖維素產(chǎn)沼氣菌群的研究及在食品剩余物中的應(yīng)用

【摘要】：實(shí)驗(yàn)以不同環(huán)境的樣品為研究對(duì)象,以無氧富集培養(yǎng)液和巨菌草為基質(zhì),對(duì)沼氣發(fā)酵過程中沼氣總產(chǎn)量、沼氣日產(chǎn)量和沼氣甲烷含量為指標(biāo),經(jīng)過富集和組配篩選出一個(gè)能高效降解巨菌草產(chǎn)沼氣的復(fù)合菌系。在發(fā)酵溫度為37℃、接種量為5%、培養(yǎng)基為100 mL條件下發(fā)酵,經(jīng)過40天發(fā)酵可以產(chǎn)生1219mL沼氣,沼氣中甲烷含量可以達(dá)到62%。與單一來源的菌種相比,組配的復(fù)合菌系產(chǎn)氣啟動(dòng)快,酸化期縮短3-5天,甲烷化提前2-3天,穩(wěn)定產(chǎn)氣期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),能使整個(gè)發(fā)酵周期時(shí)間提前5-8天,產(chǎn)氣量提高25%～50%。采用CTAB-NaCl法提取發(fā)酵不同階段菌群的總DNA,分別用細(xì)菌和古菌的16S rDNA引物擴(kuò)增其保守序列,將目的片段連接到pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌中,挑取經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后的陽性克隆子外送檢測(cè)。結(jié)果表明,90個(gè)細(xì)菌克隆子,其中25個(gè)屬于Clostridium sp.、21個(gè)屬于Treponema sp.、15個(gè)屬于Eubacterium sp. 、8個(gè)屬于Bacteriodetes sp.、2個(gè)屬于Prevotella sp.、19個(gè)屬于Uncultured,分別占菌群的27.8%、23.3%、16.7%、8.9%、2.2%、21.1%；84個(gè)古菌克隆子,其中38個(gè)屬于Methanofollis sp.、22個(gè)屬于Methanosarcina sp.、7個(gè)屬于Methanobacterium sp.、2個(gè)屬于Methanocorpusculum sp.、15個(gè)屬于Uncultured,分別占菌群的45.2%、26.2%、8.3%、2.4%、17.9%,表明了發(fā)酵沼氣菌群是一個(gè)復(fù)雜的菌系,沼氣的產(chǎn)生是多種微生物共同作用的結(jié)果。采用SYBR Green熒光定量方法對(duì)不同階段細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量進(jìn)行研究。結(jié)果表明,篩選的高產(chǎn)氣菌群發(fā)酵前期,即發(fā)酵第10天時(shí)細(xì)菌的數(shù)量為2.0×109/mL,甲烷菌的數(shù)量為7.7×103/mL；發(fā)酵中期,即發(fā)酵第20天時(shí)細(xì)菌的數(shù)量為5.2×107/mL,甲烷菌的數(shù)量為1.7×104/mL；發(fā)酵后期,即發(fā)酵第30天時(shí)細(xì)菌的數(shù)量為7.7×107/mL,甲烷菌的數(shù)量為1.1×103/mL,菌群數(shù)量與發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。以組配的復(fù)合菌系為菌種,對(duì)甘蔗渣、廢菇筒和筍頭三種食品剩余物進(jìn)行沼氣發(fā)酵研究,三種原料均表現(xiàn)出很好的產(chǎn)氣效果,30d發(fā)酵產(chǎn)氣總量均在8L以上。從產(chǎn)氣總量來看,筍頭最高,廢菇筒次之,甘蔗渣最低。從氣體甲烷含量來看,廢菇筒最高,筍頭次之,甘蔗渣最低。 【關(guān)鍵詞】：厭氧發(fā)酵 菌群結(jié)構(gòu) 菌群數(shù)量 RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：S216.4;TQ920.1
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 研究?jī)?nèi)容13-18
• 1.2.1 厭氧發(fā)酵三階段原理13-14
• 1.2.2 沼氣發(fā)酵的影響因素14-16
• 1.2.3 沼氣發(fā)酵菌群的研究16-17
• 1.2.4 產(chǎn)甲烷菌17-18
• 1.3 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀18-22
• 1.3.1 國(guó)內(nèi)外沼氣發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展18-19
• 1.3.2 沼氣發(fā)酵菌群的分子生物學(xué)研究進(jìn)展19-22
• 第二章 高產(chǎn)沼氣菌群的篩選及構(gòu)建22-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備22-23
• 2.1.1 樣品采集22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 主要試劑22-23
• 2.1.4 發(fā)酵原料23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 2.2.1 樣品采集及處理23
• 2.2.2 富集培養(yǎng)基的配制23-24
• 2.2.3 高產(chǎn)氣菌群的構(gòu)建24
• 2.2.4 分析項(xiàng)目及方法24-25
• 2.3 結(jié)果與分析25-31
• 2.3.1 菌種富集25-29
• 2.3.2 高產(chǎn)氣菌群的構(gòu)建29-31
• 2.4 總結(jié)31-32
• 第三章 發(fā)酵過程不同階段菌群種類的分析32-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料32-35
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品32
• 3.1.2 菌株與質(zhì)粒32
• 3.1.3 擴(kuò)增引物32-33
• 3.1.4 分析軟件33
• 3.1.5 主要試劑33
• 3.1.6 主要儀器33-34
• 3.1.7 主要溶液與培養(yǎng)基的配制34-35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 3.2.1 菌群DNA的提取35
• 3.2.2 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增35-36
• 3.2.3 目的DNA片段的回收36
• 3.2.4 連接反應(yīng)36
• 3.2.5 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備36-37
• 3.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化37
• 3.2.7 菌落PCR選取陽性克隆37
• 3.2.8 菌群鑒定及結(jié)構(gòu)分析37-38
• 3.3 結(jié)果與分析38-46
• 3.3.1 各階段菌群16S rDNA文庫構(gòu)建38-40
• 3.3.2 發(fā)酵各階段細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹及菌群種類40-43
• 3.3.3 發(fā)酵各階段古菌系統(tǒng)進(jìn)化樹及菌群種類43-46
• 3.4. 總結(jié)46-48
• 第四章 發(fā)酵過程不同階段菌群數(shù)量的分析48-61
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 4.1.1 樣品采集及樣品總DNA的提取48
• 4.1.2 主要試劑和儀器48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 4.2.1 引物設(shè)計(jì)48-49
• 4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建49-50
• 4.2.3 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線的建立50
• 4.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立50-51
• 4.2.5 熔解曲線分析51
• 4.2.6 菌數(shù)量的計(jì)算51
• 4.3 結(jié)果與分析51-59
• 4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建51-53
• 4.3.2 擴(kuò)增曲線的建立53-55
• 4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立55-56
• 4.3.4 熔解曲線分析56-58
• 4.3.5 菌數(shù)量的計(jì)算58-59
• 4.4 總結(jié)59-61
• 第五章 高產(chǎn)沼氣菌群在食品剩余物中的應(yīng)用61-65
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備61
• 5.1.1 接種物61
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)原料61
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備61
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法61-62
• 5.3 結(jié)果與分析62-64
• 5.3.1 不同原料產(chǎn)氣總量62-63
• 5.3.2 不同原料產(chǎn)沼氣甲烷含量63-64
• 5.4 總結(jié)64-65
• 第六章 結(jié)論與展望65-68
• 6.1 結(jié)論65-66
• 6.2 不足與展望66-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 致謝74

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