凝結(jié)芽孢桿菌利用酸爆玉米秸稈酶解液制備L-乳酸的研究

【摘要】：乳酸及其衍生物作為重要的有機(jī)化工原料和精細(xì)化學(xué)品應(yīng)用廣泛，其中將聚乳酸用于制造生物降解材料是最新也是最具有發(fā)展?jié)摿Φ挠猛局?。目前?guó)內(nèi)外生產(chǎn)乳酸的主要方法為以淀粉等糧食作物為原料的微生物發(fā)酵法?？紤]到糧食安全性問(wèn)題，在我國(guó)發(fā)展生物質(zhì)乳酸更具有特殊意義。本文選擇酸性蒸汽爆破玉米秸稈渣為原料和嗜熱菌株凝結(jié)芽孢桿菌S44作為發(fā)酵菌株，研究如何高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維原料制備乳酸技術(shù)。酸性蒸汽爆破玉米秸稈具有較高的酶解得率，凝結(jié)芽孢桿菌作為生物質(zhì)乳酸發(fā)酵菌種，具有高溫、厭氧發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，且L-乳酸光學(xué)純度較高，具有工業(yè)化應(yīng)用前景。研究主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 本論文首先建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中的有機(jī)酸及糖類(lèi)的分析方法。使用Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱，以5mmol/L的H2SO4作為流動(dòng)相，在柱溫55oC，流速0.6mL/min下，采用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法可在17min內(nèi)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中的各種有機(jī)酸和糖類(lèi)等完全分離定量，6種有機(jī)酸和3種糖類(lèi)在0.15-5.19g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，回歸方程的線性相關(guān)在0.99997以上。將該法用于米根霉和凝結(jié)桿菌發(fā)酵液的檢測(cè)，兩個(gè)水平的加標(biāo)回收率為96.91%-103.11%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.809%-4.61444%。 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)方法和Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)嗜熱菌株凝結(jié)芽孢桿菌S44發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基主要因子進(jìn)行了優(yōu)化和篩選。確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：種子培養(yǎng)時(shí)間為12h，發(fā)酵起始pH為7.2，發(fā)酵溫度50℃，培養(yǎng)時(shí)搖床的轉(zhuǎn)速為180rpm；發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果求得最佳組合為(g/L)：葡萄糖85，酵母膏干粉2.5，玉米漿干粉1.2，(NH4)2SO43.0， KH2PO40.22，MgSO47H2O0.4，MnSO4H2O0.03，F(xiàn)eSO47H2O0.03，CaCO370。此條件下85g/L葡萄糖發(fā)酵72h消耗完畢，乳酸產(chǎn)量由優(yōu)化前的59.09g/L提高到73.95g/L，比原來(lái)提高了25.2%，糖酸轉(zhuǎn)化率為86.75%，糖利用率為100%。 在搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了7L發(fā)酵罐試驗(yàn)，重點(diǎn)考察了發(fā)酵pH和補(bǔ)料方式對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響，結(jié)果表明發(fā)酵過(guò)程控制pH為6.3可達(dá)到最佳效果，85g/L葡萄糖發(fā)酵48h消耗完畢，乳酸濃度達(dá)到71g/L、糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到88.75%；起始葡萄糖濃度在高于100g/L的發(fā)酵液中存在一定的底物抑制，分批補(bǔ)料可以有效的減少底物抑制，增加發(fā)酵的總糖濃度?？偺菨舛?10g/L的發(fā)酵液分兩次補(bǔ)料發(fā)酵72h L-乳酸濃度達(dá)到82g/L，較分批發(fā)酵（58g/L）提高41.38%，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.92%。 圍繞酸性蒸汽爆破玉米秸稈渣開(kāi)展了生物質(zhì)乳酸制備技術(shù)的研究。酸性蒸汽爆破玉米秸稈渣主要富含纖維素和木質(zhì)素，酶解效果良好，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?3g纖維素/L，酶用量為15FPU/g纖維素和30CBU/g纖維素，水解48h，葡萄糖得率和纖維素酶酶解得率分別為85.02%、91.14%；添加PEG6000不僅有助于酶解效率的提高，還可降低酶用量33.3%。纖維素酶用量為10FPIU/g纖維素，β-葡萄糖苷酶用量為20CBU/g纖維素，底物濃度為110g纖維素/L的酸性蒸汽爆破玉米秸稈渣在添加0.07g/g纖維素PEG后酶解48h還原糖含量為102.89g/L，可直接用于乳酸發(fā)酵。這一結(jié)果暗示聚乙二醇輔助酶解還可進(jìn)一步促進(jìn)酸性蒸汽爆破玉米秸稈渣高濃度酶解，獲得的酶解液省略了糖濃縮環(huán)節(jié)，有效降低了生產(chǎn)成本。 利用酶解液直接進(jìn)行乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌S44可同步利用酸性蒸汽爆破玉米秸稈渣酶解液中的多種糖類(lèi)物質(zhì)。搖瓶發(fā)酵酶解液72h葡萄糖，纖維二糖和木糖利用率分別為76.23%、91.37%和100%，乳酸濃度達(dá)到50.83g/L；7L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示4L酶解液發(fā)酵42h，葡萄糖濃度降為1.07g/L、纖維二糖為2.31g/L、木糖為0.17g/L，L-乳酸產(chǎn)量為61.28g/L，補(bǔ)料2倍酶解液0.8L，繼續(xù)發(fā)酵至72h L-乳酸產(chǎn)量為75.03g/L，葡萄糖為8.34g/L，纖維二糖為1.92g/L、木糖為0.16g/L；發(fā)酵罐帶渣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示酸爆玉米秸稈渣酶解48h，葡萄糖濃度達(dá)到85.64g/L，在48h接入菌種后發(fā)酵72h乳酸濃度達(dá)到57.21g/L，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為74.11%。 【關(guān)鍵詞】：凝結(jié)芽孢桿菌 L-乳酸 酸爆玉米秸稈渣 發(fā)酵 酶解
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：TQ921.3
【目錄】：

• 致謝3-4
• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-24
• 1.1 乳酸的性質(zhì)和應(yīng)用13
• 1.2 乳酸的生產(chǎn)方法13-16
• 1.2.1 化學(xué)合成法14
• 1.2.2 酶法生成乳酸14
• 1.2.3 發(fā)酵法14-16
• 1.3 發(fā)酵乳酸的微生物16-19
• 1.3.1 傳統(tǒng)的菌株篩選和改良17-18
• 1.3.2 基因工程在育種中的應(yīng)用18-19
• 1.4 木質(zhì)纖維素發(fā)酵制乳酸研究進(jìn)展19-22
• 1.4.1 木質(zhì)纖維素原料水解工藝19-20
• 1.4.2 木質(zhì)纖維素水解液的乳酸發(fā)酵20-22
• 1.5 研究的內(nèi)容、目的與意義22-24
• 2 發(fā)酵液中乳酸與糖類(lèi)同步檢測(cè)方法的建立24-32
• 2.1 材料與方法24-25
• 2.1.1 儀器與試劑24
• 2.1.2 色譜分離條件24-25
• 2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備25
• 2.1.4 樣品預(yù)處理25
• 2.1.5 定性與定量25
• 2.2 結(jié)果與討論25-31
• 2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的確定25-26
• 2.2.2 柱溫的選擇26-27
• 2.2.3 流速的選擇27-28
• 2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制28-29
• 2.2.5 重復(fù)性和回收率試驗(yàn)29-31
• 2.3 本章小結(jié)31-32
• 3 凝結(jié)芽孢桿菌 S44 搖瓶及發(fā)酵罐優(yōu)化32-53
• 3.1 材料與方法32-34
• 3.1.1 菌株32
• 3.1.2 試劑32
• 3.1.3 主要儀器32-33
• 3.1.4 培養(yǎng)基33
• 3.1.5 培養(yǎng)條件及方法33-34
• 3.1.6 分析檢測(cè)方法34
• 3.1.6.1 殘?zhí)羌叭樗岬臏y(cè)定34
• 3.1.6.2 糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算34
• 3.2 結(jié)果與討論34-52
• 3.2.1 發(fā)酵種齡的確定34-35
• 3.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化35-38
• 3.2.2.1 起始 pH 值以及 CaCO3對(duì)發(fā)酵產(chǎn) L‐乳酸的影響35-37
• 3.2.2.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵的影響37
• 3.2.2.3 不同轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響37-38
• 3.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化38-46
• 3.2.3.1 不同起始碳源濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn) L‐乳酸的影響38-39
• 3.2.3.2 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn) L‐乳酸的影響39-40
• 3.2.3.3 通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基40-46
• 3.2.4 在優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件下發(fā)酵歷程46-47
• 3.2.5 7L 發(fā)酵罐工藝條件的研究47-52
• 3.2.5.1 pH 對(duì)發(fā)酵的影響47-49
• 3.2.5.2 提高發(fā)酵罐發(fā)酵的起始糖濃度對(duì)發(fā)酵的影響49-50
• 3.2.5.3 分批補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵的影響50-52
• 3.3 本章小結(jié)52-53
• 4 酸爆玉米秸稈渣酶解及發(fā)酵產(chǎn) L-乳酸的工藝研究53-68
• 4.1 材料與方法53-56
• 4.1.1 原料及其預(yù)處理53-54
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器54
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)所用酶54-55
• 4.1.4 酶解糖化制備木質(zhì)纖維素水解上清液55
• 4.1.5 發(fā)酵罐發(fā)酵條件55-56
• 4.1.6 分析方法56
• 4.2 結(jié)果與討論56-66
• 4.2.1 酸爆渣酶解工藝的研究56-63
• 4.2.1.1 纖維素酶酶解酸爆渣歷程56-57
• 4.2.1.2 不同分子量 PEG 對(duì)木質(zhì)纖維素水解的影響57-58
• 4.2.1.3 降低反應(yīng)體系中酶液用量58-59
• 4.2.1.4 不同纖維素濃度對(duì)木質(zhì)纖維素水解的影響59-61
• 4.2.1.5 不同 PEG 濃度對(duì)木質(zhì)纖維素水解的影響61-62
• 4.2.1.6 PEG 加入時(shí)機(jī)對(duì)木質(zhì)纖維素水解影響62-63
• 4.2.2 木質(zhì)纖維素酶解上清液搖瓶發(fā)酵 L-乳酸63-66
• 4.2.2.1 酶解上清液搖瓶發(fā)酵產(chǎn)乳酸性能研究63-64
• 4.2.2.2 酶解上清液發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)乳酸性能研究64-65
• 4.2.2.3 發(fā)酵罐酶解后直接發(fā)酵產(chǎn)乳酸性能研究65-66
• 4.3 本章小結(jié)66-68
• 5 結(jié)論與展望68-70
• 5.1 結(jié)論68-69
• 5.2 展望69-70
• 參考文獻(xiàn)70-75
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文75

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纖維素乙醇及乳酸耦合煉制過(guò)程與機(jī)理研究    唐勇

高產(chǎn)高純D-乳酸的E.coli代謝工程菌的構(gòu)建    周麗

木質(zhì)纖維素和菊芋生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸的生物煉制技術(shù)研究    陶泰河（Thai Ha Dao）

木質(zhì)纖維的降解及L-乳酸發(fā)酵技術(shù)的研究    楊雪欣

微波誘變?nèi)樗岣弋a(chǎn)菌選育及淀粉廢水發(fā)酵制乳酸工藝研究    徐偉

途徑工程改造大腸桿菌轉(zhuǎn)化甘油合成乳酸    田康明

可再生纖維素原料生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)乳酸的研究    沈雪亮

菊芋發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究    葛向陽(yáng)

米根霉液態(tài)發(fā)酵L-乳酸在線調(diào)控分析與固態(tài)發(fā)酵的研究    封文濤

L-乳酸菌的發(fā)酵及優(yōu)化條件的研究    儲(chǔ)春才

海帶乳酸發(fā)酵制品的研制及貯藏期間菌相變化的研究    肖欣欣

殘次果蔬L型乳酸發(fā)酵飲料及其功能的初步研究    徐長(zhǎng)亮

木糖制備乳酸高產(chǎn)菌的誘變選育和工藝優(yōu)化    蔡聰

乳酸生成菌的乳酸發(fā)酵調(diào)控及分子改造    孟武

雙孢蘑菇乳酸發(fā)酵飲料加工工藝研究    馬澤青

粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的研究    蘇剛

玉竹乳酸發(fā)酵飲料工藝研究    孫君

利用纖維材料生產(chǎn)L-乳酸的研究    馬慧芳