利用玉米秸稈半纖維素降解產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)乙醇菌株的篩選

【摘要】：煤炭、石油資源枯竭，地球污染在日益加重，人類現(xiàn)在亟需尋找一種新的能源以便能夠改變目前這種嚴(yán)峻的能源危機。乙醇作為一種清潔高效的能源，早已被世界各國所關(guān)注。地球上每年都產(chǎn)生數(shù)以萬計的木質(zhì)纖維素，這也為發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)提供了豐富的原材料。目前，國內(nèi)纖維素作為發(fā)酵乙醇的原料，其利用率遠低于國外最好水平，主要原因是產(chǎn)乙醇菌株對秸稈中半纖維素降解產(chǎn)物木糖的糖醇轉(zhuǎn)換率較低。 本研究對從保定周邊秸稈堆積場所采集到的樣品進行高效利用木糖產(chǎn)乙醇菌株的篩選，同時還篩選得到產(chǎn)半纖維素酶菌株，并以玉米秸稈稀酸水解液和半纖維素酶酶解液為原料，進行了乙醇發(fā)酵的初步探索和比較。 分離、篩選得到6株可利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株，初始木糖40.0g/L，(NH_4)_2SO_45.0g/L，KH_2PO_41.0g/L，酵母粉0.5g/L，MgSO_47H_2O0.5g/L，pH6.5條件下，利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力在10.46g/L-12.38g/L之間，木糖利用率在68.75%-79.17%之間，乙醇得率在0.35g/g-0.41g/g之間。對發(fā)酵時間和培養(yǎng)基成分優(yōu)化后，初始性能最佳的菌株M-105在木糖50.0g/L，(NH_4)_2SO_45.5g/L，KH_2PO_41.0g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO_47H_2O2.0g/L，pH6.5條件下發(fā)酵60h，乙醇產(chǎn)量和木糖利用率分別達23.37g/L和98.85%，乙醇得率達到了0.471g/g。篩選得到16株產(chǎn)半纖維素酶菌株，其中只有3-B009菌株酶活性較穩(wěn)，且酶活力相對較高；在對其進行發(fā)酵條件優(yōu)化后，半纖維素酶活力達341.94U/mL(17097U/g)。 在此基礎(chǔ)之上，用2%的稀硫酸對玉米秸稈進行了預(yù)處理，脫毒得到玉米秸稈水解液，HLPC-示差折光法測得濃縮水解液木糖含量為46.62g/L，不含葡萄糖。利用M-105菌株發(fā)酵水解液，乙醇產(chǎn)量和木糖利用率分別為10.29g/L和61.39%。利用3-B009發(fā)酵所得半纖維素酶粗酶液處理玉米秸稈，優(yōu)化酶液用量后，酶解48h，木糖含量5.093g/L。半纖維素水解率較低，尚無法直接用于發(fā)酵。 基于26SrDNAD1/D2結(jié)構(gòu)域序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和初步鑒定表明，高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌株M-105為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)；在土豆汁木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)5d可形成假菌絲。根據(jù)基于16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，半纖維素酶產(chǎn)生菌3-B009屬于類諾卡氏屬(Nocardioides)；高氏一號培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)3d，基絲斷裂、形成斷裂小體。 【關(guān)鍵詞】：乙醇 玉米秸稈 木糖 半纖維素酶 熱帶假絲酵
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：TQ223.122;Q93
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-24
• 1.1 概述13
• 1.2 木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的發(fā)展現(xiàn)狀及其展望13-16
• 1.2.1 國內(nèi)木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇發(fā)展現(xiàn)狀13-14
• 1.2.2 國外木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇發(fā)展現(xiàn)狀14-15
• 1.2.3 木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇展望15-16
• 1.3 玉米秸稈預(yù)處理及其脫毒研究16-20
• 1.3.1 玉米秸稈預(yù)處理研究16-19
• 1.3.2 玉米秸稈水解液的脫毒研究19-20
• 1.4 玉米秸稈發(fā)酵制乙醇技術(shù)研究20-22
• 1.4.1 一步發(fā)酵法20
• 1.4.2 兩步發(fā)酵法20-21
• 1.4.3 同步糖化發(fā)酵法21
• 1.4.4 非等溫同步糖化發(fā)酵法21
• 1.4.5 固定化方法21-22
• 1.5 微生物代謝木糖產(chǎn)乙醇機理22-23
• 1.6 本課題研究目的、意義及技術(shù)路線23-24
• 1.6.1 本課題研究目的和意義23
• 1.6.2 本課題研究技術(shù)路線23-24
• 第2章 高效利用木糖產(chǎn)乙醇菌株篩選24-40
• 2.1 實驗材料24-26
• 2.1.1 實驗樣品24
• 2.1.2 主要培養(yǎng)基24-25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 實驗主要儀器25-26
• 2.2 實驗方法26-27
• 2.2.1 樣品富集26
• 2.2.2 菌種的分離與純化26
• 2.2.3 菌種的初篩26
• 2.2.4 菌種的復(fù)篩26
• 2.2.5 菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇穩(wěn)定性測定26-27
• 2.2.6 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化27
• 2.3 實驗結(jié)果與討論27-38
• 2.3.1 初篩結(jié)果27
• 2.3.2 復(fù)篩結(jié)果27-28
• 2.3.3 利用木糖發(fā)酵性能測定結(jié)果28-32
• 2.3.4 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果32-38
• 2.4 小結(jié)38-40
• 第3章 玉米秸稈水解液的制備及其發(fā)酵產(chǎn)乙醇40-47
• 3.1 實驗材料40
• 3.1.1 菌種40
• 3.1.2 實驗主要試劑40
• 3.1.3 實驗儀器40
• 3.2 實驗方法40-41
• 3.2.1 玉米秸稈水解液的制備40
• 3.2.2 木糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作40-41
• 3.2.3 玉米秸稈水解液的主要成分分析41
• 3.2.4 玉米秸稈水解液的脫毒及其發(fā)酵產(chǎn)乙醇41
• 3.3 實驗結(jié)果與討論41-46
• 3.3.1 玉米秸稈水解液的主要成分分析41-45
• 3.3.2 玉米秸稈水解液脫毒及發(fā)酵產(chǎn)乙醇45-46
• 3.4 小結(jié)46-47
• 第4章 高效降解半纖維素菌株的篩選47-56
• 4.1 實驗材料47-48
• 4.1.1 實驗樣品47
• 4.1.2 實驗主要培養(yǎng)基47
• 4.1.3 實驗主要試劑47
• 4.1.4 實驗儀器47-48
• 4.2 實驗方法48-49
• 4.2.1 樣品富集48
• 4.2.2 菌種的分離與初篩48
• 4.2.3 分離菌的純化48
• 4.2.4 菌種的復(fù)篩48
• 4.2.5 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作48
• 4.2.6 半纖維素酶活力的測定48-49
• 4.2.7 利用半纖維素酶的粗酶液處理玉米秸稈49
• 4.3 實驗結(jié)果與討論49-53
• 4.3.1 初篩結(jié)果49
• 4.3.2 復(fù)篩結(jié)果49-50
• 4.3.3 對 3-B009 產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化50-53
• 4.4 半纖維素粗酶液處理玉米秸稈53-55
• 4.4.1 粗酶液處理玉米秸稈時間的優(yōu)化53-54
• 4.4.2 粗酶液加酶量的優(yōu)化54-55
• 4.5 小結(jié)55-56
• 第5章 菌株 M-105 和 3-B009 的初步鑒定56-66
• 5.1 實驗材料56-57
• 5.1.1 菌株來源56
• 5.1.2 主要培養(yǎng)基56
• 5.1.3 主要試劑56-57
• 5.1.4 主要儀器57
• 5.2 實驗方法57-61
• 5.2.1 培養(yǎng)和形態(tài)特征鑒定57-58
• 5.2.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育地位分析58-60
• 5.2.3 酵母菌 M-105 生理生化特征鑒定60-61
• 5.3 實驗結(jié)果61-65
• 5.3.1 M-105 菌落形態(tài)特征61-62
• 5.3.2 3-B009 培養(yǎng)和形態(tài)特征62-63
• 5.3.3 PCR 產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果63
• 5.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹63-64
• 5.3.5 酵母菌 M-105 生理生化鑒定64-65
• 5.4 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻67-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間取得的科研成果72

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