高寒草地真菌纖維素降解酶系及其對油菜秸稈降解活性的研究

【摘要】：在我國北方尤其是高寒地區(qū),油菜秸稈通常被農(nóng)牧民用作燃料,造成了資源浪費和環(huán)境污染。探索一種構(gòu)建高效降解油菜秸稈細胞壁物質(zhì)多酶系菌群的方法,采用微生物發(fā)酵技術降解油菜秸稈,對促進油菜秸稈資源循環(huán)和再生利用具有十分重要的意義。 論文以項目組前期分離獲得的來自東祁連山高寒草地土壤中的真菌菌株作為研究材料,采用底物顯色的初步篩選法和酶活力復選法,篩選出產(chǎn)羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和漆酶菌株,通過rDNA-ITS基因序列分析、培養(yǎng)特性、液體發(fā)酵粗酶液的酶學性質(zhì)及不同菌株液體發(fā)酵粗酶液之間的協(xié)同效應分析,構(gòu)建多酶系菌群,并研究多酶系菌群對油菜秸稈的降解活性,取得了以下主要結(jié)果： (1)從125株真菌菌株中篩選得到56個纖維素分解菌株,其中：有49個菌株能在濾紙平板培養(yǎng)基上生長,且不同菌株對濾紙的分解程度不同；篩選出34個既能產(chǎn)羧甲基纖維素酶又能產(chǎn)木聚糖酶的菌株,穩(wěn)定性測定后,最終獲得4株高產(chǎn)羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的菌株,經(jīng)rDNA-ITS基因序列分析,4個菌株初步鑒定為：阿太菌屬(Athelia sp.)(菌株23a)、Saccharicola sp(菌株24d)、埃里磚格孢屬(Embellisia sp.)(菌株26B)、梭孢殼屬(Thielavia sp.)(菌株H)。在56個菌株中,有9個菌株在-萘酚-PDA培養(yǎng)基和愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生褐色氧化帶,其中有6個菌株能在分別以愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、鄰苯甲苯胺為底物的選擇性培養(yǎng)基上生長,產(chǎn)生褐色氧化帶；以愈創(chuàng)木酚為底物測定漆酶活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有菌株310b產(chǎn)生漆酶。經(jīng)rDNA-ITS基因序列分析,初步鑒定為：小皮傘屬(Marasmiussp.)。 (2)對菌株310b產(chǎn)漆酶條件的研究結(jié)果表明：菌株310b在25℃、pH=4.0時產(chǎn)漆酶的酶活力最大；9種碳源抑制菌株產(chǎn)漆酶,蛋白胨誘導菌株產(chǎn)漆酶,且酶活力最高；鄰甲苯胺、-萘酚和吐溫-80等3種非營養(yǎng)有機物促進菌株產(chǎn)漆酶,愈創(chuàng)木酚對菌株產(chǎn)漆酶沒有明顯的作用；鄰苯二酚、單寧酸、吲哚乙酸抑制菌株產(chǎn)漆酶,其中吲哚乙酸抑制作用最強烈；隨Cu2-增加,產(chǎn)漆酶活力增加,0.025g/L時產(chǎn)酶活力最大；隨著接種量的增加,誘導菌株產(chǎn)漆酶；轉(zhuǎn)速在0～180r min-1范圍內(nèi),隨著轉(zhuǎn)速的增加,漆酶的酶活力增加,且轉(zhuǎn)速達到180r min-1時,酶活力達到最大。 (3)5個菌株生長的最適溫度范圍在25-35℃之間,25℃條件下菌株兩兩混合培養(yǎng)7d后,發(fā)現(xiàn)5個菌株間可以共存。5個菌株產(chǎn)酶的種類及酶活力大小不同,菌株26B產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶活力最高,24d產(chǎn)生的木聚糖酶活最高；將不同菌株的發(fā)酵粗酶液兩兩等體積混合后,與對應的單個菌株的酶活力相比較,反應體系中羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和漆酶的酶活力下降,5個菌株間隨機組合進行液體發(fā)酵后,單個菌株和組合菌株反應體系中的酶活力t測驗結(jié)果表明,漆酶的酶活力變化差異顯著(p0.05),但在菌株26B、310b和24d的不同組合中,羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活力變化差異不顯著(p0.05)。 (4)產(chǎn)羧甲基纖維素酶菌株26B在55℃、pH=6時酶的催化活性達到最大值,菌株23a在30℃、pH=5時酶的催化活性達到最大值,菌株H在50℃、pH=5.5時酶的催化活性達到最大值；菌株26B產(chǎn)生羧甲基纖維素酶對熱不穩(wěn)定,菌株23a和H的羧甲基纖維素酶在0-40℃相對穩(wěn)定。產(chǎn)木聚糖酶菌株24d在55℃、pH=5時酶的催化活性達到最大值。菌株23a在35℃、pH=5.5時酶的催化活性達到最大值,菌株H在55℃、pH=5.0時酶的催化活性達到最大值。菌株24d產(chǎn)生的木聚糖酶對熱不穩(wěn)定,菌株23a和H的木聚糖酶在0-35℃相對穩(wěn)定。產(chǎn)漆酶菌株310b在30℃、pH=4.5時酶的催化活性達到最大值,且在0-45℃酶活力相對穩(wěn)定。 (5)將菌株26B、310b和24d等3個菌株組合后進行固體發(fā)酵,結(jié)果表明,相比于其他組合,固體發(fā)酵60d后,反應體系中的相對還原糖含量高,相對纖維素含量低,油菜秸稈顏色變淺、菌絲附著多,掃描電鏡結(jié)果顯示,與對照相比,秸稈表面、斷裂處、秸稈髓部等都發(fā)生了明顯的變化。菌株310b、24d和26B組合的多酶系菌群對油菜秸稈的降解效果明顯。 【關鍵詞】：高寒草地 纖維素降解酶系 油菜秸稈 細胞壁物質(zhì) 降解活性
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：X172;X712
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文獻綜述11-26
• 1 纖維素類物質(zhì)資源及研究降解纖維素類物質(zhì)真菌的意義11-12
• 1.1 纖維素類物質(zhì)資源11
• 1.2 研究降解纖維素類物質(zhì)真菌的意義11-12
• 2 降解纖維素類物質(zhì)真菌的研究方法12-16
• 2.1 分離方法12
• 2.2 篩選方法12-16
• 2.2.1 初步篩選12-13
• 2.2.2 復選13-16
• 2.2.2.1 酶活力篩選法13
• 2.2.2.2 合菌群篩選法13-14
• 2.2.2.3 誘變選育法14-15
• 2.2.2.4 基因篩選法15-16
• 2.3 降解纖維素類物質(zhì)真菌DNA多態(tài)性分析16
• 3 高寒草地降解纖維素類物質(zhì)微生物生態(tài)過程和功能的研究16-21
• 3.1 我國草地微生物生態(tài)的研究概況17
• 3.2 微生物功能群的界定及降解纖維素類物質(zhì)微生物的生態(tài)學研究17-19
• 3.2.1 微生物功能群的界定17-18
• 3.2.2 高寒草地降解纖維素類物質(zhì)微生物的生態(tài)學研究18-19
• 3.3 降解纖維素類物質(zhì)微生物的生態(tài)過程19-20
• 3.4 高寒草地降解纖維素類物質(zhì)微生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能20
• 3.5 存在的問題20-21
• 4 高寒地區(qū)油菜秸稈資源及再生利用的意義21-24
• 4.1 油菜秸稈資源21
• 4.2 油菜秸稈資源的利用狀況21-23
• 4.3 高寒地區(qū)油菜秸稈資源再生利用的意義23-24
• 5 論文的研究意義、研究內(nèi)容和技術路線24-26
• 5.1 研究意義24
• 5.2 研究內(nèi)容24-25
• 5.3 技術路線25-26
• 第二章 纖維素分解真菌和產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及分子鑒定26-38
• 1 材料與方法27-30
• 1.1 供試菌株及來源27
• 1.2 培養(yǎng)基27-28
• 1.3 研究方法28-30
• 1.3.1 初步篩選28
• 1.3.1.1 羧甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基篩選法28
• 1.3.1.2 濾紙平板培養(yǎng)基篩選法28
• 1.3.1.3 濾紙分解度實驗28
• 1.3.2 產(chǎn)酶菌株復選28-30
• 1.3.2.1 繪制標準曲線28-29
• 1.3.2.2 粗酶液的制備29
• 1.3.2.3 酶活力測定29-30
• 1.3.3 纖維素分解真菌菌株的穩(wěn)定性測定30
• 1.3.4 rDNA-ITS鑒定30
• 2 結(jié)果與分析30-35
• 2.1 初步篩選結(jié)果30-32
• 2.2 復選結(jié)果32
• 2.3 菌株的穩(wěn)定性及酶活力測定結(jié)果32-33
• 2.4 分子鑒定結(jié)果33-35
• 3 討論35-37
• 4 小結(jié)37-38
• 第三章 產(chǎn)漆酶菌株的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的初步研究38-47
• 1 材料與方法39-40
• 1.1 供試菌株39
• 1.2 培養(yǎng)基39-40
• 1.3 研究方法40
• 1.3.1 初步篩選40
• 1.3.2 粗酶液的制備及漆酶活力測定40
• 1.3.3 rDNA-ITS鑒定40
• 1.3.4 產(chǎn)酶條件的研究40
• 1.4 數(shù)據(jù)處理及分析40
• 2 結(jié)果與分析40-45
• 2.1 初步篩選結(jié)果40-41
• 2.2 復選結(jié)果41
• 2.3 分子鑒定結(jié)果41-42
• 2.4 產(chǎn)漆酶條件的研究結(jié)果42-45
• 2.4.1 溫度對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響42
• 2.4.2 初始pH值對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響42
• 2.4.3 C源對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響42-43
• 2.4.4 N源對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響43
• 2.4.5 非營養(yǎng)有機物對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響43
• 2.4.6 Cu~(2+)對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響43
• 2.4.7 接種量對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響43
• 2.4.8 轉(zhuǎn)速對菌株310b產(chǎn)漆酶的影響43-45
• 3 討論45
• 4 小結(jié)45-47
• 第四章 高產(chǎn)酶活菌株的培養(yǎng)特性47-54
• 1 材料與方法47-48
• 1.1 供試菌株47
• 1.2 培養(yǎng)基47-48
• 1.3 研究方法48
• 1.3.1 培養(yǎng)特性48
• 1.3.2 菌株間相互關系48
• 1.4 數(shù)據(jù)處理及分析48
• 2 結(jié)果與分析48-51
• 2.1 溫度對菌株生長的影響48-49
• 2.2 不同碳源對菌株生長的影響49-50
• 2.3 不同氮源對真菌生長的影響50-51
• 2.4 菌株間的相互關系51
• 3 討論51-53
• 4 小結(jié)53-54
• 第五章 高產(chǎn)酶活菌株的酶學性質(zhì)54-62
• 1 材料與方法54-55
• 1.1 供試菌株54-55
• 1.2 研究方法55
• 1.2.1 酶活力測定55
• 1.2.2 粗酶液酶學性質(zhì)55
• 2 結(jié)果與分析55-60
• 2.1 菌株產(chǎn)酶種類及相對酶活力大小比較55-56
• 2.2 不同菌株發(fā)酵粗酶液的酶學性質(zhì)56-60
• 2.2.1 產(chǎn)羧甲基纖維素酶的酶學性質(zhì)56-58
• 2.2.2 產(chǎn)木聚糖酶的酶學性質(zhì)58-59
• 2.2.3 產(chǎn)漆酶的酶學性質(zhì)59-60
• 3 討論60-61
• 4 小結(jié)61-62
• 第六章 5株菌株不同酶系間協(xié)同作用62-69
• 1 材料與方法62-63
• 1.1 供試菌株62
• 1.2 研究方法62-63
• 1.2.1 不同菌株發(fā)酵粗酶液等體積混合酶活力測定62
• 1.2.2 不同菌株組合液體發(fā)酵產(chǎn)酶分析62-63
• 2 結(jié)果與分析63-67
• 2.1 不同菌株粗酶液混合酶活力的變化63-64
• 2.2 菌株組合液體發(fā)酵酶活力的變化64-65
• 2.3 菌株組合液體發(fā)酵不同酶系間協(xié)同作用分析65-67
• 3 討論67-68
• 4 小結(jié)68-69
• 第七章 多酶系菌群對油菜秸稈降解活性的研究69-79
• 1 材料與方法69-71
• 1.1 供試菌株69-70
• 1.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基70
• 1.3 研究方法70-71
• 1.3.1 多酶系菌群組合設計70
• 1.3.2 油菜秸稈降解活性研究70-71
• 2 結(jié)果與分析71-76
• 2.1 固體發(fā)酵粗酶液酶活力的變化71-72
• 2.2 不同組合固體發(fā)酵體系還原糖含量的變化72
• 2.3 多酶系菌群降解油菜秸稈細胞壁物質(zhì)效果72-74
• 2.3.1 油菜秸稈降解的感官評價72-73
• 2.3.2 油菜秸稈纖維素含量的測定結(jié)果73-74
• 2.4 粗酶液酶活力與降解活性之間的相關性分析74-75
• 2.5 多酶系菌群對秸稈表面降解的掃描電鏡分析75-76
• 3 討論76-78
• 4 小結(jié)78-79
• 第八章 主要結(jié)論與研究展望79-81
• 1.1 主要結(jié)論79
• 1.2 創(chuàng)新點79
• 1.3 存在問題79-80
• 1.4 研究展望80-81
• 參考文獻81-95
• 導師簡介95-96
• 個人簡介96-97
• 致謝97

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貴州持續(xù)農(nóng)業(yè)中的土壤肥力與水土保持問題    陳旭暉

兩種還田模式下玉米秸稈分解速率的比較    馬永良,宇振榮,江永紅,羅維

三組微生物菌群分解油菜秸稈的消化液性質(zhì)比較    呂育財;崔宗均;王小芬;李寧;龔大春;

青黃貯對三河牛產(chǎn)乳量及乳成分的影響    崔久輝;郭德瑞;吳宏軍;管延江;王東升;

靈芝固態(tài)發(fā)酵油菜秸稈氮源對木質(zhì)素酶系分泌的影響    柯麗霞;張丁倩;

溆浦：油菜秸稈還田 保護農(nóng)村環(huán)境    記者 肖軍　黃巍 通訊員 王繼云 李水明 黃輝

秸稈還田PK“狼煙四起”    王震波

還一片沃土藍天    本報記者 趙天冬

居巢區(qū)秸稈還田“做給群眾看”    王震波

省城出臺秸稈利用新規(guī)    記者 張鳴

重慶：農(nóng)機市場空間較大    汪文

各地秸稈禁燒有措施    本報記者 趙天冬

重新審視秸稈價值    郭耀華

“想不到秸稈還田機這么神”    本報通訊員 姜斌

沃土工程促荊門糧豐民富    本報記者 何紅衛(wèi) 通訊員 杜華清

高寒草地真菌纖維素降解酶系及其對油菜秸稈降解活性的研究    蘆光新

木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇過程中關鍵問題的研究    呂學斌

粉碎及氨化油菜秸飼喂威寧黃牛效果的研究    黃瑞鵬

不同微貯制劑及其組合處理油菜秸稈的營養(yǎng)價值評定    王亮

油菜秸稈厭氧發(fā)酵特性與產(chǎn)氣潛力研究    孫全平

改性油菜秸稈纖維素對蛋白質(zhì)吸附性能的研究    石熒原

蟹味菇菌株離子束誘變選育及油菜秸稈栽培研究    董先茹

油菜秸稈發(fā)酵及其新型無土栽培基質(zhì)的研究    汪季濤

生物質(zhì)秸稈熱特性的測定分析及DSC曲線擬合    郭兵海

以油菜秸稈為主要基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)盾殼霉分生孢子的工藝改進    王愛琴

核盤菌重寄生菌盾殼霉的固體發(fā)酵及分生孢子菌劑制備的研究    王英超

油菜秸稈的表面改性及其在木塑材料中的應用    王艷麗