嗜熱菌W16利用秸稈水解液混合糖產氫特性及代謝機制研究

【摘要】：廢棄物處理能源化符合國家節(jié)能減排和低碳發(fā)展戰(zhàn)略需求,也是環(huán)境領域關注的熱點問題之一。利用豐富而廉價的可再生秸稈類生物質制取氫氣是一種獲得氫氣的新方法,在產生可再生清潔能源的同時可以有效解決農業(yè)廢棄物的處置問題,是未來能源發(fā)展的主要趨勢。然而,由于秸稈類生物質的復雜性及難降解性,如何高效獲取富含葡萄糖和木糖混合糖的秸稈水解液,以及解決目前發(fā)酵產氫微生物木糖代謝能力不足的問題對于實現(xiàn)秸稈廢棄物資源的高值利用至關重要。本研究以本實驗室篩選得到的能夠利用葡萄糖木糖發(fā)酵嗜熱產氫菌熱解糖厭氧芽孢桿菌W16(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16)為研究對象,以建立經濟高效轉化秸稈類生物質產氫體系為目標展開研究,考察了產氫菌W16葡萄糖木糖共利用發(fā)酵產氫規(guī)律,提出了采用補料分批發(fā)酵方式解決混合底物中木糖利用率低的問題;并分析了不同葡萄糖木糖碳源響應下細胞的代謝差異特征及可能的代謝調控機制,為實現(xiàn)葡萄糖木糖混合糖的同步高效轉化提供重要的理論基礎;在此基礎上,采用生物法預處理及酶解糖化玉米秸稈,探討了產氫菌W16利用玉米秸稈水解液發(fā)酵產氫效能,為實現(xiàn)農業(yè)廢棄物玉米秸稈的高值利用以及生物轉化過程經濟可行性提供技術理論依據(jù)。通過不同葡萄糖木糖混合糖濃度比下發(fā)酵產氫特性,確定了產氫菌W16能夠同時利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產氫,但與葡萄糖的利用相比,木糖的消耗速率隨著混合糖中葡萄糖濃度的升高而不斷下降,結合節(jié)點插值擬合分析表明,當混合糖中葡萄糖含量高于58.2.%時,其對木糖利用的抑制作用明顯增大,而當葡萄糖含量降至21.7%以下,其自身利用會受到一定程度反饋抑制。針對高葡萄糖木糖濃度比下木糖利用率低的問題,提出連續(xù)以及補料分批發(fā)酵過程稀釋率及水力停留時間(Hydraulic retention time,HRT)調控策略,其中采用補料分批發(fā)酵方式,通過控制各段運行參數(shù),在HRT為12h條件下,產氫速率達到最大值8.9 mmol/L/h的同時,相應的葡萄糖木糖利用率分別提升至92.2%以及82.2%。采用Illumina 2000高通量測序平臺轉錄組學測序技術探究產氫菌W16葡萄糖木糖共發(fā)酵產氫內在分子機理。對產氫菌W16在葡萄糖,木糖以及葡萄糖木糖混合糖作為碳源下差異基因的調控與表達情況進行分析,結果表明產氫菌W16在不同碳源下編碼木糖特異性轉運蛋白基因高豐度是實現(xiàn)葡萄糖木糖共利用的主要因素。而當葡萄糖在混合糖中大量存在時,木糖異構酶的高葡萄糖親和力導致即使木糖轉運蛋白基因高豐度,木糖利用仍受到一定程度抑制。當混合糖基質中木糖大量存在時,葡萄糖磷酸轉移酶系統(tǒng)基因豐度普遍下降,造成葡萄糖利用減緩。以上糖轉運蛋白在不同混合糖下表達差異是菌株W16實現(xiàn)葡萄糖木糖共發(fā)酵,并且在發(fā)酵過程中存在相互影響的主要原因?；诰闣16利用葡萄糖木糖發(fā)酵產氫特點,建立合理有效的玉米秸稈預處理及酶解糖化方式。通過不同預處理方式下玉米秸稈化學組分及形態(tài)結構比較結果表明,采用白腐真菌CGMCC 5.776(Phanerochaete chrysosporium CGMCC 5.776)生物預處理玉米秸稈在去除35.3%木質素,降低纖維素結晶度的同時,只有9.5%的全纖維素損失。該預處理過程可以有效強化玉米秸稈酶解糖化效能至原來的1.6倍。同時,選用綠色木霉CGMCC 3.2876(Trichoderma viride CGMCC 3.2876)胞外粗酶液對生物預處理玉米秸稈進行酶解糖化,在溫度49.7°C,p H 5.0,酶投加量35.7 IU/g,以及底物濃度為38.5 g/L的最優(yōu)條件下,每100g玉米秸稈能夠產生27.2g可溶性還原糖,高達理論值的67%。通過采用批式,連續(xù)以及補料分批發(fā)酵方式發(fā)酵產氫發(fā)現(xiàn),在補料分批發(fā)酵方式下產氫菌W16利用生物預處理玉米秸稈水解液發(fā)酵產氫,最高產氫速率可達到9.1 mmol/L/h。為進一步提高產氫效能,提出了糖水解-暗發(fā)酵一體式產氫對策,實驗結果表明,通過調整反應過程中溫度,底物濃度以及酶投加量,糖化及發(fā)酵產氫過程可以在有效縮短反應時間至72h的同時,產氫量達到89.3 m L H2/g-玉米秸稈。 【關鍵詞】：秸稈 預處理 酶解糖化 葡萄糖木糖共利用 生物制氫 熱解糖厭氧芽孢桿菌W16
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X172;X712
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 第1章 緒論16-38
• 1.1 課題背景16-17
• 1.1.1 課題來源16
• 1.1.2 能源現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢16-17
• 1.2 氫能與生物制氫技術17-20
• 1.2.1 氫能的優(yōu)越性及應用17-18
• 1.2.2 發(fā)酵法生物制氫研究進展18-20
• 1.3 秸稈原料的開發(fā)潛力20-23
• 1.3.1 秸稈原料利用現(xiàn)狀20-21
• 1.3.2 秸稈的化學組成和結構21-23
• 1.4 秸稈水解液混合糖的獲取23-28
• 1.4.1 秸稈原料的預處理23-26
• 1.4.2 預處理秸稈原料的糖化26-28
• 1.5 秸稈水解液葡萄糖木糖發(fā)酵產氫28-35
• 1.5.1 秸稈水解液葡萄糖木糖發(fā)酵產氫微生物28-32
• 1.5.2 秸稈水解液葡萄糖木糖發(fā)酵產氫工藝32-35
• 1.6 本文的研究目的和意義35-36
• 1.7 本文的主要研究內容和技術路線36-38
• 1.7.1 主要研究內容36-37
• 1.7.2 技術路線37-38
• 第2章 試驗材料與方法38-53
• 2.1 試驗材料38-41
• 2.1.1 菌種來源38
• 2.1.2 玉米秸稈38
• 2.1.3 培養(yǎng)基38-39
• 2.1.4 儀器與設備39-40
• 2.1.5 試驗裝置40-41
• 2.2 試驗方法41-46
• 2.2.1 玉米秸稈原料的預處理41
• 2.2.2 預處理后玉米秸稈的酶解糖化41-43
• 2.2.3 玉米秸稈水解液發(fā)酵產氫43
• 2.2.4 cDNA文庫構建及轉錄組測序43-46
• 2.3 分析方法46-53
• 2.3.1 細胞生物量的測定46-47
• 2.3.2 氫氣含量的測定47
• 2.3.3 可溶性還原糖含量的測定47
• 2.3.4 液相末端發(fā)酵產物的測定47
• 2.3.5 玉米秸稈原料成分的測定47-48
• 2.3.6 纖維素酶半纖維素酶活性的測定48-49
• 2.3.7 蛋白含量的測定49-50
• 2.3.8 掃描電鏡觀測50
• 2.3.9 傅里葉紅外光譜掃描分析50
• 2.3.10 發(fā)酵動力學分析50-51
• 2.3.11 數(shù)據(jù)分析51-53
• 第3章 嗜熱菌W16葡萄糖木糖共利用產氫特性研究53-78
• 3.1 引言53-54
• 3.2 菌株W16批式發(fā)酵產氫特性研究54-63
• 3.2.1 菌株W16批式發(fā)酵生長特性54-55
• 3.2.2 菌株W16批式發(fā)酵底物消耗特性55-58
• 3.2.3 菌株W16批式發(fā)酵產氫特性58-60
• 3.2.4 菌株W16混合糖發(fā)酵產氫過程擬合60-63
• 3.3 菌株W16連續(xù)發(fā)酵產氫特性研究63-69
• 3.3.1 菌株W16不同碳源連續(xù)發(fā)酵產氫特性研究63-66
• 3.3.2 菌株W16不同稀釋率下連續(xù)發(fā)酵產氫特性66-69
• 3.4 菌株W16補料分批發(fā)酵產氫特性研究69-77
• 3.4.1 菌株W16不同碳源補料分批發(fā)酵產氫特性研究70-72
• 3.4.2 菌株W16不同HRT補料分批發(fā)酵產氫特性研究72-77
• 3.5 本章小結77-78
• 第4章 嗜熱菌W16葡萄糖木糖共利用代謝機制研究78-94
• 4.1 引言78
• 4.2 菌株W16不同碳源下測序質量評估78-82
• 4.2.1 堿基質量評估78-79
• 4.2.2 與參考基因比對統(tǒng)計79-81
• 4.2.3 基因覆蓋度統(tǒng)計81-82
• 4.3 菌株W16不同碳源下基因差異表達分析82-88
• 4.3.1 菌株W16在葡萄糖和混合糖組中基因差異表達分析82-86
• 4.3.2 菌株W16在混合糖和木糖組中基因差異表達分析86-88
• 4.3.3 菌株W16在葡萄糖和木糖組中基因差異表達分析88
• 4.4 菌株W16不同碳源下基因GO功能富集分析88-91
• 4.5 菌株W16不同碳源下KEGG通路分析91-93
• 4.6 本章小節(jié)93-94
• 第5章 嗜熱菌W16利用玉米秸稈水解液發(fā)酵產氫研究94-119
• 5.1 引言94-95
• 5.2 玉米秸稈原料的預處理95-102
• 5.2.1 不同玉米秸稈預處理方式比較95-98
• 5.2.2 生物法預處理玉米秸稈98-102
• 5.3 預處理后玉米秸稈原料的酶解糖化條件優(yōu)化102-108
• 5.3.1 響應面法優(yōu)化酶解糖化條件102-104
• 5.3.2 二次回歸模型的建立及顯著性分析104-105
• 5.3.3 預處理玉米秸稈酶解糖化響應面分析與優(yōu)化105-106
• 5.3.4 生物預處理玉米秸稈產糖能力分析106-108
• 5.4 分步糖化發(fā)酵產氫研究108-112
• 5.4.1 菌株W16利用玉米秸稈水解液批式發(fā)酵產氫108-110
• 5.4.2 菌株W16利用玉米秸稈水解液連續(xù)發(fā)酵產氫110
• 5.4.3 菌株W16利用玉米秸稈水解液補料分批方式發(fā)酵產氫110-112
• 5.5 同步糖化發(fā)酵產氫研究112-117
• 5.5.1 底物濃度對同步糖化發(fā)酵產氫的影響112-114
• 5.5.2 酶投加量對同步糖化發(fā)酵產氫的影響114-115
• 5.5.3 p H對同步糖化發(fā)酵產氫的影響115-116
• 5.5.4 生物預處理玉米秸稈最佳條件同步糖化發(fā)酵產氫116-117
• 5.6 不同木質纖維原料發(fā)酵產氫能力比較117-118
• 5.7 本章小結118-119
• 結論119-122
• 參考文獻122-138
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文及其它成果138-142
• 致謝142-143
• 個人簡歷143

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