嗜熱菌W16利用秸稈水解液混合糖產(chǎn)氫特性及代謝機(jī)制研究

【摘要】：廢棄物處理能源化符合國家節(jié)能減排和低碳發(fā)展戰(zhàn)略需求,也是環(huán)境領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。利用豐富而廉價的可再生秸稈類生物質(zhì)制取氫氣是一種獲得氫氣的新方法,在產(chǎn)生可再生清潔能源的同時可以有效解決農(nóng)業(yè)廢棄物的處置問題,是未來能源發(fā)展的主要趨勢。然而,由于秸稈類生物質(zhì)的復(fù)雜性及難降解性,如何高效獲取富含葡萄糖和木糖混合糖的秸稈水解液,以及解決目前發(fā)酵產(chǎn)氫微生物木糖代謝能力不足的問題對于實(shí)現(xiàn)秸稈廢棄物資源的高值利用至關(guān)重要。本研究以本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的能夠利用葡萄糖木糖發(fā)酵嗜熱產(chǎn)氫菌熱解糖厭氧芽孢桿菌W16(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16)為研究對象,以建立經(jīng)濟(jì)高效轉(zhuǎn)化秸稈類生物質(zhì)產(chǎn)氫體系為目標(biāo)展開研究,考察了產(chǎn)氫菌W16葡萄糖木糖共利用發(fā)酵產(chǎn)氫規(guī)律,提出了采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式解決混合底物中木糖利用率低的問題;并分析了不同葡萄糖木糖碳源響應(yīng)下細(xì)胞的代謝差異特征及可能的代謝調(diào)控機(jī)制,為實(shí)現(xiàn)葡萄糖木糖混合糖的同步高效轉(zhuǎn)化提供重要的理論基礎(chǔ);在此基礎(chǔ)上,采用生物法預(yù)處理及酶解糖化玉米秸稈,探討了產(chǎn)氫菌W16利用玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫效能,為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈的高值利用以及生物轉(zhuǎn)化過程經(jīng)濟(jì)可行性提供技術(shù)理論依據(jù)。通過不同葡萄糖木糖混合糖濃度比下發(fā)酵產(chǎn)氫特性,確定了產(chǎn)氫菌W16能夠同時利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)氫,但與葡萄糖的利用相比,木糖的消耗速率隨著混合糖中葡萄糖濃度的升高而不斷下降,結(jié)合節(jié)點(diǎn)插值擬合分析表明,當(dāng)混合糖中葡萄糖含量高于58.2.%時,其對木糖利用的抑制作用明顯增大,而當(dāng)葡萄糖含量降至21.7%以下,其自身利用會受到一定程度反饋抑制。針對高葡萄糖木糖濃度比下木糖利用率低的問題,提出連續(xù)以及補(bǔ)料分批發(fā)酵過程稀釋率及水力停留時間(Hydraulic retention time,HRT)調(diào)控策略,其中采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式,通過控制各段運(yùn)行參數(shù),在HRT為12h條件下,產(chǎn)氫速率達(dá)到最大值8.9 mmol/L/h的同時,相應(yīng)的葡萄糖木糖利用率分別提升至92.2%以及82.2%。采用Illumina 2000高通量測序平臺轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)探究產(chǎn)氫菌W16葡萄糖木糖共發(fā)酵產(chǎn)氫內(nèi)在分子機(jī)理。對產(chǎn)氫菌W16在葡萄糖,木糖以及葡萄糖木糖混合糖作為碳源下差異基因的調(diào)控與表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明產(chǎn)氫菌W16在不同碳源下編碼木糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因高豐度是實(shí)現(xiàn)葡萄糖木糖共利用的主要因素。而當(dāng)葡萄糖在混合糖中大量存在時,木糖異構(gòu)酶的高葡萄糖親和力導(dǎo)致即使木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因高豐度,木糖利用仍受到一定程度抑制。當(dāng)混合糖基質(zhì)中木糖大量存在時,葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因豐度普遍下降,造成葡萄糖利用減緩。以上糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同混合糖下表達(dá)差異是菌株W16實(shí)現(xiàn)葡萄糖木糖共發(fā)酵,并且在發(fā)酵過程中存在相互影響的主要原因?；诰闣16利用葡萄糖木糖發(fā)酵產(chǎn)氫特點(diǎn),建立合理有效的玉米秸稈預(yù)處理及酶解糖化方式。通過不同預(yù)處理方式下玉米秸稈化學(xué)組分及形態(tài)結(jié)構(gòu)比較結(jié)果表明,采用白腐真菌CGMCC 5.776(Phanerochaete chrysosporium CGMCC 5.776)生物預(yù)處理玉米秸稈在去除35.3%木質(zhì)素,降低纖維素結(jié)晶度的同時,只有9.5%的全纖維素?fù)p失。該預(yù)處理過程可以有效強(qiáng)化玉米秸稈酶解糖化效能至原來的1.6倍。同時,選用綠色木霉CGMCC 3.2876(Trichoderma viride CGMCC 3.2876)胞外粗酶液對生物預(yù)處理玉米秸稈進(jìn)行酶解糖化,在溫度49.7°C,p H 5.0,酶投加量35.7 IU/g,以及底物濃度為38.5 g/L的最優(yōu)條件下,每100g玉米秸稈能夠產(chǎn)生27.2g可溶性還原糖,高達(dá)理論值的67%。通過采用批式,連續(xù)以及補(bǔ)料分批發(fā)酵方式發(fā)酵產(chǎn)氫發(fā)現(xiàn),在補(bǔ)料分批發(fā)酵方式下產(chǎn)氫菌W16利用生物預(yù)處理玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫,最高產(chǎn)氫速率可達(dá)到9.1 mmol/L/h。為進(jìn)一步提高產(chǎn)氫效能,提出了糖水解-暗發(fā)酵一體式產(chǎn)氫對策,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過調(diào)整反應(yīng)過程中溫度,底物濃度以及酶投加量,糖化及發(fā)酵產(chǎn)氫過程可以在有效縮短反應(yīng)時間至72h的同時,產(chǎn)氫量達(dá)到89.3 m L H2/g-玉米秸稈。 【關(guān)鍵詞】：秸稈 預(yù)處理 酶解糖化 葡萄糖木糖共利用 生物制氫 熱解糖厭氧芽孢桿菌W16
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X172;X712
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 第1章 緒論16-38
• 1.1 課題背景16-17
• 1.1.1 課題來源16
• 1.1.2 能源現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢16-17
• 1.2 氫能與生物制氫技術(shù)17-20
• 1.2.1 氫能的優(yōu)越性及應(yīng)用17-18
• 1.2.2 發(fā)酵法生物制氫研究進(jìn)展18-20
• 1.3 秸稈原料的開發(fā)潛力20-23
• 1.3.1 秸稈原料利用現(xiàn)狀20-21
• 1.3.2 秸稈的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)21-23
• 1.4 秸稈水解液混合糖的獲取23-28
• 1.4.1 秸稈原料的預(yù)處理23-26
• 1.4.2 預(yù)處理秸稈原料的糖化26-28
• 1.5 秸稈水解液葡萄糖木糖發(fā)酵產(chǎn)氫28-35
• 1.5.1 秸稈水解液葡萄糖木糖發(fā)酵產(chǎn)氫微生物28-32
• 1.5.2 秸稈水解液葡萄糖木糖發(fā)酵產(chǎn)氫工藝32-35
• 1.6 本文的研究目的和意義35-36
• 1.7 本文的主要研究內(nèi)容和技術(shù)路線36-38
• 1.7.1 主要研究內(nèi)容36-37
• 1.7.2 技術(shù)路線37-38
• 第2章 試驗(yàn)材料與方法38-53
• 2.1 試驗(yàn)材料38-41
• 2.1.1 菌種來源38
• 2.1.2 玉米秸稈38
• 2.1.3 培養(yǎng)基38-39
• 2.1.4 儀器與設(shè)備39-40
• 2.1.5 試驗(yàn)裝置40-41
• 2.2 試驗(yàn)方法41-46
• 2.2.1 玉米秸稈原料的預(yù)處理41
• 2.2.2 預(yù)處理后玉米秸稈的酶解糖化41-43
• 2.2.3 玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫43
• 2.2.4 cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序43-46
• 2.3 分析方法46-53
• 2.3.1 細(xì)胞生物量的測定46-47
• 2.3.2 氫氣含量的測定47
• 2.3.3 可溶性還原糖含量的測定47
• 2.3.4 液相末端發(fā)酵產(chǎn)物的測定47
• 2.3.5 玉米秸稈原料成分的測定47-48
• 2.3.6 纖維素酶半纖維素酶活性的測定48-49
• 2.3.7 蛋白含量的測定49-50
• 2.3.8 掃描電鏡觀測50
• 2.3.9 傅里葉紅外光譜掃描分析50
• 2.3.10 發(fā)酵動力學(xué)分析50-51
• 2.3.11 數(shù)據(jù)分析51-53
• 第3章 嗜熱菌W16葡萄糖木糖共利用產(chǎn)氫特性研究53-78
• 3.1 引言53-54
• 3.2 菌株W16批式發(fā)酵產(chǎn)氫特性研究54-63
• 3.2.1 菌株W16批式發(fā)酵生長特性54-55
• 3.2.2 菌株W16批式發(fā)酵底物消耗特性55-58
• 3.2.3 菌株W16批式發(fā)酵產(chǎn)氫特性58-60
• 3.2.4 菌株W16混合糖發(fā)酵產(chǎn)氫過程擬合60-63
• 3.3 菌株W16連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)氫特性研究63-69
• 3.3.1 菌株W16不同碳源連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)氫特性研究63-66
• 3.3.2 菌株W16不同稀釋率下連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)氫特性66-69
• 3.4 菌株W16補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)氫特性研究69-77
• 3.4.1 菌株W16不同碳源補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)氫特性研究70-72
• 3.4.2 菌株W16不同HRT補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)氫特性研究72-77
• 3.5 本章小結(jié)77-78
• 第4章 嗜熱菌W16葡萄糖木糖共利用代謝機(jī)制研究78-94
• 4.1 引言78
• 4.2 菌株W16不同碳源下測序質(zhì)量評估78-82
• 4.2.1 堿基質(zhì)量評估78-79
• 4.2.2 與參考基因比對統(tǒng)計79-81
• 4.2.3 基因覆蓋度統(tǒng)計81-82
• 4.3 菌株W16不同碳源下基因差異表達(dá)分析82-88
• 4.3.1 菌株W16在葡萄糖和混合糖組中基因差異表達(dá)分析82-86
• 4.3.2 菌株W16在混合糖和木糖組中基因差異表達(dá)分析86-88
• 4.3.3 菌株W16在葡萄糖和木糖組中基因差異表達(dá)分析88
• 4.4 菌株W16不同碳源下基因GO功能富集分析88-91
• 4.5 菌株W16不同碳源下KEGG通路分析91-93
• 4.6 本章小節(jié)93-94
• 第5章 嗜熱菌W16利用玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫研究94-119
• 5.1 引言94-95
• 5.2 玉米秸稈原料的預(yù)處理95-102
• 5.2.1 不同玉米秸稈預(yù)處理方式比較95-98
• 5.2.2 生物法預(yù)處理玉米秸稈98-102
• 5.3 預(yù)處理后玉米秸稈原料的酶解糖化條件優(yōu)化102-108
• 5.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解糖化條件102-104
• 5.3.2 二次回歸模型的建立及顯著性分析104-105
• 5.3.3 預(yù)處理玉米秸稈酶解糖化響應(yīng)面分析與優(yōu)化105-106
• 5.3.4 生物預(yù)處理玉米秸稈產(chǎn)糖能力分析106-108
• 5.4 分步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫研究108-112
• 5.4.1 菌株W16利用玉米秸稈水解液批式發(fā)酵產(chǎn)氫108-110
• 5.4.2 菌株W16利用玉米秸稈水解液連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)氫110
• 5.4.3 菌株W16利用玉米秸稈水解液補(bǔ)料分批方式發(fā)酵產(chǎn)氫110-112
• 5.5 同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫研究112-117
• 5.5.1 底物濃度對同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫的影響112-114
• 5.5.2 酶投加量對同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫的影響114-115
• 5.5.3 p H對同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫的影響115-116
• 5.5.4 生物預(yù)處理玉米秸稈最佳條件同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫116-117
• 5.6 不同木質(zhì)纖維原料發(fā)酵產(chǎn)氫能力比較117-118
• 5.7 本章小結(jié)118-119
• 結(jié)論119-122
• 參考文獻(xiàn)122-138
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果138-142
• 致謝142-143
• 個人簡歷143

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