稻田甲烷排放的微生物群落結構組成及活性初步研究

【摘要】：稻田是大氣甲烷排放的重要源。我國稻谷產(chǎn)量世界第一、水稻種植面積世界第二，稻田甲烷排放不同地區(qū)水稻土的甲烷排放有一定的差異，微生物則是稻田甲烷產(chǎn)生和氧化的生物源，研究我國稻田甲烷排放的微生物機制具有重要意義。本論文針對我國典型稻田土壤，圍繞稻田甲烷產(chǎn)生和甲烷氧化過程，采用微生物分子生態(tài)學方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)、實時熒光定量(qPCR)、變性梯度凝膠電泳分子指紋圖譜(DGGE)、克隆文庫和穩(wěn)定性同位素核酸探針等技術，研究了長期氮肥施用以及大氣CO_2濃度升高下稻田土壤產(chǎn)甲烷古菌的豐度和群落結構變化規(guī)律，進一步研究了三種典型稻田土壤甲烷氧化動力學規(guī)律及其微生物作用者，主要研究結果如下： 1、長期施用（22年）無機有機混合肥（NPK/OM）導致產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量增加，并可能促進甲烷八疊球菌的生長，但產(chǎn)甲烷古菌整體微生物群落組成變化較小。長期單獨施用無機氮肥對產(chǎn)甲烷古菌群落結構影響較小。 2、大氣CO_2濃度升高（FACE）促進水稻分蘗期產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量的增加，在2009年分蘗期非根際土壤中達到了顯著性水平，而對揚花期、拔節(jié)期和灌漿期的產(chǎn)甲烷古菌豐度有一定的抑制作用。與根際土壤相比，非根際土壤受到的抑制作用較小。此外，與施用低氮肥相比較，施用高氮肥在一定程度降低了土壤產(chǎn)甲烷古菌的數(shù)量。 3、低甲烷初始濃度（700ug·L~(-1)）條件下，廣東雷州稻田土壤的甲烷氧化速率最小，湖南古市稻田土壤和湖南桃源稻田土壤的甲烷氧化速率較為一致；高濃度甲烷（7000ug·L~(-1)）條件下，湖南古市稻田土壤的甲烷氧化速率最大，廣東雷州和湖南桃源的稻田土壤甲烷氧化速率較為一致。進一步采用穩(wěn)定性同位素13C示蹤稻田土壤中甲烷氧化細菌的核酸DNA結果表明三種稻田土壤中活性甲烷氧化細菌種類不同，湖南古市稻田土壤中類型Ⅰ甲烷氧化細菌占所有甲烷氧化細菌的77.8%（克隆文庫數(shù)據(jù)）；湖南桃源稻田土壤中類型Ⅱ型甲烷氧化細菌占所有克隆序列的80%；類型I甲烷氧化細菌主導了廣東雷州稻田土壤甲烷氧化。結果表明類型I和類型II甲烷氧化細菌的活性具有一定差異，是稻田土壤甲烷氧化能力空間變異的重要因子。 總之，盡管水稻土中產(chǎn)甲烷古菌微生物群落組成較為穩(wěn)定，但有機無機氮肥混合施用、大氣CO_2濃度升高可能增加稻田土壤產(chǎn)甲烷古菌的數(shù)量。典型稻田土壤的甲烷氧化動力學過程及其甲烷氧化微生物作用者具有一定的地理分布規(guī)律。 【關鍵詞】：施肥 FACE 產(chǎn)甲烷古菌 甲烷氧化細菌 穩(wěn)定性同位素核酸探針
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：S511;S181
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 1 文獻綜述8-17
• 1.1 產(chǎn)甲烷古菌的生理學與系統(tǒng)發(fā)育史的研究進展8-10
• 1.1.1 稻田產(chǎn)甲烷古菌的分類及多樣性8-9
• 1.1.2 稻田產(chǎn)甲烷古菌的代謝與系統(tǒng)發(fā)育的關系9-10
• 1.2 甲烷氧化細菌的生理學與系統(tǒng)發(fā)育史的研究進展10-11
• 1.2.1 稻田甲烷氧化細菌的分類及多樣性10-11
• 1.2.2 稻田甲烷氧化細菌的代謝與系統(tǒng)發(fā)育的關系11
• 1.3 影響稻田甲烷排放因素的研究進展11-13
• 1.3.1 土壤性質對稻田甲烷排放的影響11-12
• 1.3.1.1 土壤氧化還原電位（Eh）11
• 1.3.1.2 土壤有機質11-12
• 1.3.1.3 土壤溫度12
• 1.3.1.4 土壤的其他理化性質12
• 1.3.2 耕作管理對稻田甲烷排放的影響12-13
• 1.3.2.1 排水管理12-13
• 1.3.2.2 施肥13
• 1.3.3 植物對稻田甲烷排放的影響13
• 1.4 稻田甲烷排放相關微生物的生態(tài)學方法13-17
• 1.4.1 穩(wěn)定性同位素核酸探針技術13-14
• 1.4.2 分子指紋圖譜分析技術（PCR-DGGE）14-15
• 1.4.3 實時熒光定量 PCR 技術（qPCR）15-17
• 2 引言17-19
• 3 材料與方法19-29
• 3.1 實驗材料19-20
• 3.1.1 長期施肥處理的土壤樣品采集19
• 3.1.2 FACE 處理的土壤樣品采集19-20
• 3.1.2.1 樣地概況19
• 3.1.2.2 土樣采集19-20
• 3.1.3 三種典型稻田土壤樣品采集20
• 3.2 實驗設計20-21
• 3.3 主要試劑與儀器21-22
• 3.3.1 土壤微生物基因組 DNA 提取21
• 3.3.2 熒光實時定量 PCR21
• 3.3.3 分子指紋圖譜分析 DGGE21
• 3.3.4 克隆21
• 3.3.5 甲烷氧化培養(yǎng)實驗21
• 3.3.6 超高速密度梯度離心及分層實驗21
• 3.3.7 其他試劑與設備21-22
• 3.4 測定項目與方法22-29
• 3.4.1 土壤理化性質的測定22
• 3.4.1.1 全氮、全碳的測定22
• 3.4.1.2 硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的測定22
• 3.4.1.3 pH 的測定22
• 3.4.1.4 有機質的測定22
• 3.4.1.5 含水量的測定22
• 3.4.1.6 最大持水量的測定22
• 3.4.2 土壤微生物基因組 DNA 提取22-23
• 3.4.3 土壤產(chǎn)甲烷古菌和甲烷氧化細菌的定量分析23-24
• 3.4.3.1 土壤產(chǎn)甲烷古菌的定量分析23-24
• 3.4.3.2 土壤甲烷氧化細菌的定量分析24
• 3.4.4 土壤產(chǎn)甲烷古菌群落的分子指紋圖譜分析24-25
• 3.4.4.1 產(chǎn)甲烷古菌 16S rRNA 基因的 PCR24
• 3.4.4.2 DGGE24
• 3.4.4.3 克隆測序以及基因序列比對24-25
• 3.4.5 三種典型稻田土壤甲烷氧化的預培養(yǎng)25-26
• 3.4.6 三種典型稻田土壤甲烷氧化菌的13C 標記培養(yǎng)26
• 3.4.7 超高速密度梯度離心及分層26-28
• 3.4.8 構建13C-DNA 的 pmoA 基因克隆文庫28-29
• 4 結果與分析29-41
• 4.1 不同施肥模式對稻田土壤產(chǎn)甲烷古菌群落結構的影響29-32
• 4.1.1 長期不同施肥模式對土壤基本屬性的影響29
• 4.1.2 長期不同施肥模式對產(chǎn)甲烷古菌功能基因 mcrA 數(shù)量的影響29-30
• 4.1.3 長期不同施肥模式對產(chǎn)甲烷古菌組成的影響30-32
• 4.2 未來大氣 CO_2升高（FACE）下稻田土壤產(chǎn)甲烷古菌豐度的變化規(guī)律32-34
• 4.2.1 FACE 處理對產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量的影響32-33
• 4.2.2 FACE 處理下產(chǎn)甲烷古菌的年際變化規(guī)律33-34
• 4.3 三種典型稻田土壤的甲烷氧化動力學規(guī)律及其微生物作用者34-41
• 4.3.1 土壤樣品的理化性質34-35
• 4.3.2 典型稻田土壤甲烷氧化過程的動力學變化規(guī)律35-36
• 4.3.3 三種典型稻田土壤樣品的13CH4標記36-37
• 4.3.4 超高速密度梯度離心分層樣品的 pmoA 定量分析37
• 4.3.5 甲烷氧化細菌功能基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析37-41
• 5 討論41-44
• 5.1 長期施肥處理后產(chǎn)甲烷古菌豐度及群落結構的變化41
• 5.2 FACE 處理與氮肥施用量相互作用后產(chǎn)甲烷古菌豐度的變化41-42
• 5.3 三種典型稻田土壤中甲烷氧化細菌的活性及群落組成的差異42-44
• 6 結論44-45
• 7 參考文獻45-51
• 附錄51-52
• 作者簡介52-53
• 致謝53

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