厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷菌群功能基因克隆及分析研究

【摘要】：產(chǎn)甲烷菌群是厭氧顆粒污泥中的重要功能菌群。甲基輔酶M還原酶（MCR）是產(chǎn)甲烷菌所特有的酶，mcrA基因編碼MCR的α亞基。本論文以取自工業(yè)化UASB反應器中處理維生素B12和阿維菌素廢水的厭氧顆粒污泥為研究對象，采用PCR-DGGE、基因克隆文庫等分子生物學手段，基于mcrA基因對厭氧顆粒污泥中的產(chǎn)甲烷菌群組成和結構進行研究，獲取產(chǎn)甲烷菌群的多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關系等信息。此外，還對構建出的功能基因工程菌對厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性的影響進行初步研究。研究獲得以下結果： 對不同污泥樣品基于mcrA基因所得的DGGE圖譜條帶模式存在差異，表明在不同環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌群結構有所不同，產(chǎn)甲烷菌群中優(yōu)勢種群易受環(huán)境影響而發(fā)生變化。根據(jù)DGGE圖譜計算不同污泥樣品的產(chǎn)甲烷菌群多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)，結果顯示，由于兩種工業(yè)廢水的特性不同造成環(huán)境壓力的差異，導致相應厭氧顆粒污泥中產(chǎn)甲烷菌群的多樣性不同，處理維生素B12廢水的污泥樣品的產(chǎn)甲烷菌群顯示出更高的多樣性和豐富度。 將兩種污泥樣品DGGE圖譜條帶進行測序分析比對，確定了污泥中產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢種屬，并對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析。其中，維生素B12厭氧顆粒污泥中，產(chǎn)甲烷八疊球菌目甲烷鬃菌屬為優(yōu)勢種屬，此外，還有少量甲烷桿菌目；阿維菌素厭氧顆粒污泥中，產(chǎn)甲烷八疊球菌目甲烷鬃菌屬為優(yōu)勢種屬，此外，還有一部分為甲烷八疊球菌屬和甲烷桿菌目。 采用構建基因克隆文庫的方法基于mcrA基因對兩種污泥樣品進行研究，結果顯示：處理維生素B12廢水的厭氧顆粒污泥中的產(chǎn)甲烷菌有產(chǎn)甲烷八疊球菌目、產(chǎn)甲烷微菌目和產(chǎn)甲烷桿菌目，其中，產(chǎn)甲烷八疊球菌目為優(yōu)勢種群；處理阿維菌素廢水的厭氧顆粒污泥中的產(chǎn)甲烷菌多樣性相對較低，只檢測出產(chǎn)甲烷八疊球菌目和產(chǎn)甲烷桿菌目，其中，產(chǎn)甲烷八疊球菌目甲烷鬃菌屬為優(yōu)勢種屬。 克隆文庫與PCR-DGGE對厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷菌群的分析結果存在一定差異。就VB12厭氧顆粒污泥而言，兩種方法均檢測出產(chǎn)甲烷八疊球菌目為優(yōu)勢種群，而少量的產(chǎn)甲烷微菌目僅被克隆文庫檢測到，表明構建基因克隆文庫能更全面的獲取菌群組成信息。 在構建基因克隆文庫的過程中，得到功能基因工程菌，考察其對厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性的影響，結果發(fā)現(xiàn)：投加基因工程菌降低了厭氧顆粒污泥的累積產(chǎn)甲烷量，但提高了厭氧顆粒污泥的最大產(chǎn)甲烷速率。同時，投加基因工程菌后，系統(tǒng)pH值降低的速度和程度均有所增大。由此推測，基因工程菌的投加，可能有利于產(chǎn)酸過程，進而提高產(chǎn)甲烷速率；同時，乙酸加速積累導致pH值快速降低，抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性，造成厭氧顆粒污泥的累積產(chǎn)甲烷量明顯降低。 【關鍵詞】：厭氧顆粒污泥 產(chǎn)甲烷菌群分析 克隆文庫 PCR-DGGE 生物強化 產(chǎn)甲烷活性
【學位授予單位】：河北科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：X172
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 厭氧顆粒污泥10-13
• 1.1.1 厭氧顆粒污泥的特性10-11
• 1.1.2 厭氧顆粒污泥的形成11-13
• 1.2 厭氧顆粒污泥中的主要菌群13-14
• 1.2.1 水解發(fā)酵菌13
• 1.2.2 產(chǎn)乙酸菌13-14
• 1.2.3 產(chǎn)甲烷菌14
• 1.3 產(chǎn)甲烷菌的研究進展14-17
• 1.3.1 傳統(tǒng)的微生物學分析方法14-15
• 1.3.2 基于 16S rRNA 的分子生物學方法15
• 1.3.3 基于功能基因的分子生物學方法15-17
• 1.4 生物強化技術17-20
• 1.4.1 特定功能微生物的選育17-18
• 1.4.2 生物強化作用原理18-19
• 1.4.3 生物強化技術在廢水處理中的應用19-20
• 1.5 本課題研究內容與意義20-21
• 1.5.1 研究內容20
• 1.5.2 研究目的與意義20-21
• 第2章 實驗材料和方法21-28
• 2.1 實驗材料21
• 2.2 實驗方法21-28
• 2.2.1 顆粒污泥總 DNA 提取方法21-22
• 2.2.2 聚合酶鏈式反應（PCR）22
• 2.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）22-24
• 2.2.4 克隆24-26
• 2.2.5 基因工程菌對厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性的影響26-28
• 第3章 厭氧顆粒污泥中產(chǎn)甲烷菌群 PCR-DGGE 分析28-35
• 3.1 厭氧顆粒污泥總 DNA 的提取28-29
• 3.2 功能基因的 PCR 擴增29
• 3.3 厭氧顆粒污泥中產(chǎn)甲烷菌群分析29-33
• 3.3.1 菌群多樣性分析29-31
• 3.3.2 菌群結構分析31-33
• 3.3.3 菌群功能分析及比較33
• 3.4 本章小結33-35
• 第4章 厭氧顆粒污泥中產(chǎn)甲烷菌群克隆文庫構建及種群分析35-41
• 4.1 功能基因的純化及定量35
• 4.2 陽性克隆的篩選35-36
• 4.3 陽性克隆的鑒定36-37
• 4.4 產(chǎn)甲烷菌功能基因克隆文庫構建及種群分析37-40
• 4.4.1 處理 VB12廢水的厭氧顆粒污泥中的產(chǎn)甲烷菌群分析37-38
• 4.4.2 處理阿維菌素廢水的厭氧顆粒污泥中的產(chǎn)甲烷菌群分析38-39
• 4.4.3 菌群功能分析及比較39-40
• 4.5 本章小結40-41
• 第5章 厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷過程的生物強化41-49
• 5.1 基因工程菌對厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性的影響41-44
• 5.2 不同 pH 值下基因工程菌對厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性的影響44-48
• 5.3 本章小結48-49
• 結論49-51
• 參考文獻51-56
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文56-57
• 致謝57

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