低溫石油烴降解產(chǎn)甲烷富集物的培養(yǎng)及微生物群落結(jié)構(gòu)分析

【摘要】：本論文選用原油和代表性烷烴-正十六烷烴作為碳源，采用傳統(tǒng)的Hungate厭氧操作技術(shù)，在15℃低溫條件下進(jìn)行產(chǎn)甲烷富集培養(yǎng)；應(yīng)用生物地球化學(xué)的方法（氣相色譜、液相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀）監(jiān)測(cè)石油烴的降解與甲烷產(chǎn)生過程；同時(shí)采用T-RFLP技術(shù)和16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)檢測(cè)富集培養(yǎng)過程中古菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)，并結(jié)合熒光定量qPCR技術(shù)和454高通量測(cè)序技術(shù)揭示產(chǎn)甲烷條件下厭氧烴降解可能的關(guān)鍵微生物類群；最后采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析可能參與厭氧烴降解產(chǎn)甲烷過程的相關(guān)蛋白。取得主要研究成果如下： （1）發(fā)現(xiàn)15℃厭氧烴降解產(chǎn)甲烷富集物既能夠降解單一烷烴正十六烷烴（200ul）也能夠降解復(fù)雜化合物原油（1g），甲烷產(chǎn)量分別達(dá)到了2mmol和3.7mmol，正十六烷烴的延滯期比原油降解的延滯期長(zhǎng)；經(jīng)過生物降解原油的正構(gòu)烷烴色譜圖有顯著地不同，從單駝峰型轉(zhuǎn)變?yōu)殡p峰了，短鏈烷烴降解（n23）優(yōu)于長(zhǎng)鏈烷烴降解（n23）。 （2）發(fā)現(xiàn)15℃厭氧烴降解產(chǎn)甲烷富集物中同時(shí)存在乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌和氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，古菌克隆文庫(kù)分為4個(gè)OTU。其中27%的古菌克隆屬于Hydrogenotrophic Methanoculleus，67.5%的古菌克隆與乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌甲烷鬃毛菌屬M(fèi)ethanosaeta concilii GP6（T-RF284bp）相似性高達(dá)99.9%。隨著甲烷的產(chǎn)量累積，T-RF284bp片段的豐度也隨之增加，因此，T-RF284bp片段代表的乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌在產(chǎn)甲烷條件下石油烴厭氧生物降解中起著關(guān)鍵的作用。 （3）發(fā)現(xiàn)15℃厭氧烴降解產(chǎn)甲烷富集物中的細(xì)菌群落主要包括Deltaproteobacteria (65.93%)、Mollicutes (9.29%)、 Bacterodia (2.1%)、 Clostridiales (6.1%), Anaerolineales (6.19%)、Betaproteobateria (1.1%)和Alphaproteobacteria (2.1%)組成。結(jié)合T-RFLP和克隆文庫(kù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌T-RFs207bp是正十六烷烴降解產(chǎn)甲烷過程中的核心片段，其中T-RF207bp代表的微生物與Syntrophus sp.AJ133795的相似性為98.7%，結(jié)合熒光定量qPCR分析發(fā)現(xiàn)，隨著甲烷含量的積累，Syntrophaceae拷貝數(shù)隨之增加，這類微生物可能是正十六烷烴降解轉(zhuǎn)化過程中重要微生物類群。 （4）由于蛋白濃度低等問題，沒有鑒定出產(chǎn)甲烷條件下厭氧烴降解過程中的關(guān)鍵蛋白，但是鑒定出與脂肪酸代謝（β氧化）相關(guān)的酶：反式-2-烯酰輔酶A還原酶、一氧化碳脫氫酶（CODH)，其中反式-2-烯酰輔酶A還原酶就是β氧化中水合的關(guān)鍵酶，根據(jù)厭氧烴降解的代謝途徑，它可能通過脂肪酸代謝（β氧化）進(jìn)行后續(xù)的代謝。 【關(guān)鍵詞】：低溫 石油烴 Syntrophaceae 群落結(jié)構(gòu) 454高通量測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：X172
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 研究背景13
• 1.2 研究目的和意義13-14
• 1.2.1 低溫條件下石油烴厭氧生物降解研究13-14
• 1.2.2 石油烴厭氧生物降解過程中的功能基因和功能蛋白14
• 1.3 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀14-23
• 1.3.1 石油烴厭氧生物降解的微生物學(xué)研究14-17
• 1.3.2 石油烴厭氧生物降解的機(jī)理研究17-19
• 1.3.3 石油烴厭氧生物降解中的功能基因及關(guān)鍵酶19-21
• 1.3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用21-23
• 第2章 低溫石油烴降解產(chǎn)甲烷富集物的培養(yǎng)及微生物群落結(jié)構(gòu)分析23-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>23
• 2.2 材料和方法23-29
• 2.2.1 樣品來源23
• 2.2.2 儀器和試劑23-24
• 2.2.3 培養(yǎng)基24
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-42
• 2.3.1 低溫產(chǎn)甲烷條件下厭氧石油烴降解的生物地球化學(xué)特征29-31
• 2.3.2 低溫條件下石油烴生物降解產(chǎn)甲烷富集物的古菌群落結(jié)構(gòu)31-33
• 2.3.3 低溫條件下石油烴生物降解產(chǎn)甲烷富集物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)33-39
• 2.3.4 454 高通量數(shù)據(jù)分析39-41
• 2.3.5 熒光定量分析 16S rRNA 基因41-42
• 2.4 討論42-44
• 2.4.1 石油烴厭氧降解產(chǎn)甲烷過程中的重要群落42-43
• 2.4.2 石油烴厭氧降解產(chǎn)甲烷過程中的甲烷產(chǎn)生途徑43-44
• 第3章 正十六烷烴厭氧降解產(chǎn)甲烷富集物中相關(guān)蛋白分析及鑒定44-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募凹夹g(shù)路線44-45
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>44
• 3.1.2 技術(shù)路線44-45
• 3.2 材料和方法45-50
• 3.2.1 樣品來源45
• 3.2.2 儀器和試劑45
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法45-48
• 3.2.4 雙向電泳分析不同碳源厭氧富集物差異蛋白技術(shù)體系的建立48-50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-63
• 3.3.1 不同碳源產(chǎn)甲烷條件下厭氧石油烴降解的甲烷含量變化50-52
• 3.3.2 不同碳源產(chǎn)甲烷條件下厭氧石油烴降解的群落結(jié)構(gòu)分析52-56
• 3.3.3 不同碳源產(chǎn)甲烷條件下厭氧石油烴降解富集物細(xì)胞脂肪酸分析56-59
• 3.3.4 不同碳源產(chǎn)甲烷條件下厭氧石油烴降解富集物差異蛋白分析59-63
• 3.4 討論63-65
• 3.4.1 厭氧烴降解產(chǎn)甲烷過程中的相關(guān)蛋白63
• 3.4.2 厭氧烴降解產(chǎn)甲烷過程中的相關(guān)基因63-65
• 第4章 全文結(jié)論、工作不足與展望65-67
• 4.1 全文總結(jié)65-66
• 4.1.1 低溫產(chǎn)甲烷條件下厭氧微生物的群落結(jié)構(gòu)分析65-66
• 4.1.2 產(chǎn)甲烷條件下厭氧石油烴降解相關(guān)蛋白66
• 4.2 工作不足與展望66-67
• 4.2.1 未獲得起始烴降解的功能基因66
• 4.2.2 未獲得起始烴降解的功能蛋白66
• 4.2.3 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與宏基因組數(shù)據(jù)的結(jié)合分析有待進(jìn)一步加強(qiáng)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 致謝74-76
• 作者簡(jiǎn)歷76

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