厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的組成及其代謝產(chǎn)物的特征

【摘要】：石油烴厭氧降解產(chǎn)甲烷過(guò)程的研究對(duì)于深入認(rèn)識(shí)油藏環(huán)境石油烴厭氧降解、油污染環(huán)境微生物修復(fù)以及殘余油氣化技術(shù)具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。目前,對(duì)于厭氧烴降解產(chǎn)甲烷過(guò)程的研究大多都基于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)研究,對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)的厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的組成及其變化的研究卻很有限。本文利用不同來(lái)源樣品(油藏產(chǎn)出液和含油活性污泥)成功地構(gòu)建了兩個(gè)厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系,通過(guò)分子生物學(xué)和化學(xué)分析方法,研究了這兩個(gè)菌系的菌群組成、功能基因以及代謝產(chǎn)物的特征,探討了菌系中的菌群動(dòng)態(tài)變化和可能存在的代謝機(jī)制。 提出了一種由羧酸合成特定位置氘代烷烴的“兩步法”,壬酸發(fā)生a位置氘代和Kolbe電解反應(yīng),在優(yōu)化的反應(yīng)條件下制備8,8,9,9-d4-十六烷,用作厭氧烴降解培養(yǎng)的底物進(jìn)行代謝途徑的研究。該方法也可以用于合成其它相鄰兩個(gè)碳原子氘代的烷烴。 以油藏產(chǎn)出液為基礎(chǔ),構(gòu)建了高溫厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系。加入混合烷烴(C15-C20)在55℃富集培養(yǎng)749天的樣品中檢測(cè)到141μmol甲烷,約占理論產(chǎn)甲烷量的17.1%。GC-MS檢測(cè)到多種可能的下游代謝產(chǎn)物(包括直鏈脂肪酸、揮發(fā)性脂肪酸和延胡索酸)存在,同時(shí)說(shuō)明從烷烴到甲烷的轉(zhuǎn)化并不完全。16S rRNA基因克隆文庫(kù)分析表明,該厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的菌群結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生了變化。長(zhǎng)期加烴富集培養(yǎng)體系中細(xì)菌是以Firmicutes的Gelria和Moorella為主,古菌的主要類(lèi)型為Crenarchaeotes以及氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。另外,富集培養(yǎng)樣品中都檢測(cè)到了類(lèi)似于編碼烷基琥珀酸合成酶α-亞基的功能基因(assA),特別在培養(yǎng)749天的樣品中檢測(cè)到一種不同類(lèi)型的assA基因,說(shuō)明富集培養(yǎng)中存在著有烴降解功能的微生物。在該加烴富集培養(yǎng)中可能存在的厭氧烴降解產(chǎn)甲烷代謝途徑為：在Firmicutes和Crenarchaeotes類(lèi)型厭氧菌的作用下,烷烴可能通過(guò)延胡索酸加成的方式進(jìn)行初始活化,再被連續(xù)降解為脂肪酸之后,轉(zhuǎn)化為甲酸、乙酸、氫氣和二氧化碳,并由乙酸營(yíng)養(yǎng)型和氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)生甲烷,產(chǎn)甲烷過(guò)程以二氧化碳還原途徑為主。 含油活性污泥菌系中,加入混合烷烴(C15-C20)在37℃富集培養(yǎng)后,檢測(cè)到314μmol甲烷產(chǎn)生,有37.3%的烷烴被消耗。分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,最終細(xì)菌的主要類(lèi)型為Clostridia、Actinobacteria、Synergistaceae和Chloroflexi,古菌是以乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為主。將富集培養(yǎng)406天的不加烴對(duì)照分別加入十六烷、全氘代十六烷和8,8,9,9-d4-十六烷進(jìn)行轉(zhuǎn)接,經(jīng)過(guò)660天的培養(yǎng),均檢測(cè)到甲烷的產(chǎn)生和烷烴的消耗。特別是在加入8,8,9,9-d4-十六烷的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中,甲烷的產(chǎn)量為107μmol,約占理論產(chǎn)甲烷量的83.6%,這也進(jìn)一步證明該菌系具有厭氧烴降解產(chǎn)甲烷的活性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,所有轉(zhuǎn)接培養(yǎng)樣品中都檢測(cè)到assA類(lèi)基因,菌群結(jié)構(gòu)也都經(jīng)歷了一些變化,最終細(xì)菌的主要類(lèi)型為Chloroflexi、Synergistaceae、Actinobacteria和Deltaproteobacteria,古菌以乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為主,但在產(chǎn)甲烷活性較高的加入8,8,9,9-d4-十六烷的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)則是以氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為主。在該轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中,烷烴可能通過(guò)延胡索酸加成的方式進(jìn)行初始活化,并由大量共生發(fā)酵菌將烷烴連續(xù)厭氧轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)(如乙酸),再由乙酸營(yíng)養(yǎng)型和氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)生甲烷,并以二氧化碳還原產(chǎn)甲烷的途徑為主。 通過(guò)對(duì)上述兩個(gè)不同來(lái)源的厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的分析發(fā)現(xiàn),它們的菌群組成等方面存在明顯差異,含油活性污泥中富含有機(jī)質(zhì),使得菌群結(jié)構(gòu)更為多樣。這也說(shuō)明不同的樣品來(lái)源、底物以及培養(yǎng)條件會(huì)對(duì)厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的菌群組成產(chǎn)生影響,可能也會(huì)影響整個(gè)菌系實(shí)際厭氧烴降解產(chǎn)甲烷的能力。本文的研究結(jié)果豐富了厭氧烴降解產(chǎn)甲烷微生物的多樣性,增加了對(duì)于厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌群結(jié)構(gòu)變化的了解,也拓展了對(duì)于功能基因等方面的認(rèn)識(shí),對(duì)厭氧烴降解產(chǎn)甲烷機(jī)制的研究、功能微生物的篩選和評(píng)價(jià)以及厭氧烴降解產(chǎn)甲烷活動(dòng)的監(jiān)測(cè)具有重要價(jià)值。 【關(guān)鍵詞】：厭氧烴降解 產(chǎn)甲烷 菌群組成 烷基琥珀酸合成酶 代謝產(chǎn)物
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：X703
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 前言14-36
• 1.1 厭氧烴降解的研究概況14-15
• 1.2 厭氧烴降解微生物15-20
• 1.2.1 芳烴厭氧降解微生物15-17
• 1.2.2 烷烴厭氧降解微生物17-19
• 1.2.3 厭氧烴降解微生物的培養(yǎng)19-20
• 1.3 厭氧烴降解的代謝方式20-26
• 1.3.1 脫氫羥基化21
• 1.3.2 延胡索酸加成21-24
• 1.3.3 可能和未知的方式24-25
• 1.3.4 厭氧烴降解代謝途徑的推測(cè)25-26
• 1.4 厭氧烴降解的代謝產(chǎn)物26-30
• 1.4.1 代謝產(chǎn)物的類(lèi)型27-28
• 1.4.2 代謝產(chǎn)物的分析28-30
• 1.5 氘代烷烴的合成30-34
• 1.5.1 氘代烷烴的應(yīng)用30
• 1.5.2 氘代烷烴的合成方法30-31
• 1.5.3 Kolbe電解法31-34
• 1.6 本文研究目的與意義34-35
• 1.7 本文研究思路35-36
• 第2章 特定位置氘代十六烷的合成36-56
• 2.1 材料與方法36-43
• 2.1.1 儀器36
• 2.1.2 試劑36-37
• 2.1.3 壬酸α位置氘代反應(yīng)37-38
• 2.1.4 Kolbe電解反應(yīng)38-41
• 2.1.5 反應(yīng)產(chǎn)物的分析41-43
• 2.2 結(jié)果與討論43-54
• 2.2.1 壬酸α位置氘代反應(yīng)條件的確定43-46
• 2.2.2 Kolbe電解反應(yīng)條件的確定46-53
• 2.2.3 8,8,9,9-d_4-十六烷的制備53-54
• 2.3 本章小結(jié)54-56
• 第3章 厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的構(gòu)建56-66
• 3.1 材料與方法56-59
• 3.1.1 儀器56
• 3.1.2 試劑56-57
• 3.1.3 接種樣品來(lái)源57
• 3.1.4 培養(yǎng)基的配制57-58
• 3.1.5 富集和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)58-59
• 3.1.6 化學(xué)分析59
• 3.2 結(jié)果與討論59-65
• 3.2.1 用油藏產(chǎn)出液構(gòu)建厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系59-61
• 3.2.2 用含油活性污泥構(gòu)建厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系61-65
• 3.3 本章小結(jié)65-66
• 第4章 厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的菌群組成66-98
• 4.1 材料與方法66-69
• 4.1.1 儀器66
• 4.1.2 試劑66-67
• 4.1.3 DNA的提取67
• 4.1.4 PCR擴(kuò)增16S rRNA片段和DGGE67-68
• 4.1.5 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和克隆文庫(kù)構(gòu)建68-69
• 4.1.6 測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析69
• 4.2 結(jié)果69-91
• 4.2.1 油藏產(chǎn)出液菌系中細(xì)菌的菌群組成69-72
• 4.2.2 油藏產(chǎn)出液菌系中古菌的菌群組成72-75
• 4.2.3 含油活性污泥菌系中細(xì)菌的菌群組成75-88
• 4.2.4 含油活性污泥菌系中古菌的菌群組成88-91
• 4.3 討論91-96
• 4.3.1 油藏產(chǎn)出液菌系中菌群結(jié)構(gòu)的變化91-92
• 4.3.2 油藏產(chǎn)出液菌系中的產(chǎn)甲烷途徑92-93
• 4.3.3 含油活性污泥菌系中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化93-94
• 4.3.4 含油活性污泥菌系中古菌菌群結(jié)構(gòu)的變化94-96
• 4.3.5 不同厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系中菌群組成的差異96
• 4.4 本章小結(jié)96-98
• 第5章 厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的assA基因和代謝產(chǎn)物98-111
• 5.1 材料與方法98-100
• 5.1.1 試劑98-99
• 5.1.2 PCR擴(kuò)增assA基因99
• 5.1.3 構(gòu)建assA基因克隆文庫(kù)99
• 5.1.4 測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析99
• 5.1.5 代謝產(chǎn)物分析99-100
• 5.2 結(jié)果100-107
• 5.2.1 油藏產(chǎn)出液菌系中的assA基因100-101
• 5.2.2 油藏產(chǎn)出液菌系中的代謝產(chǎn)物101-103
• 5.2.3 含油活性污泥菌系中的assA基因103-105
• 5.2.4 含油活性污泥菌系中的代謝產(chǎn)物105-107
• 5.3 討論107-109
• 5.3.1 油藏產(chǎn)出液菌系中assA基因的動(dòng)態(tài)變化107
• 5.3.2 油藏產(chǎn)出液菌系中可能存在的代謝途徑107-108
• 5.3.3 含油活性污泥菌系中assA基因的動(dòng)態(tài)變化108-109
• 5.3.4 含油活性污泥菌系中可能存在的代謝途徑109
• 5.4 本章小結(jié)109-111
• 第6章 結(jié)論與展望111-114
• 6.1 結(jié)論111-113
• 6.2 展望113-114
• 參考文獻(xiàn)114-132
• 致謝132-133
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文情況133-135
• 附錄135-136

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