混合菌修復石油污染土壤的最佳方案

　　 石油及其制品在生產(chǎn)、加工、運輸和使用過程中產(chǎn)生的大量石油污染物進入環(huán)境，對土壤造成了嚴重污染，因此對石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術中，與物理修復、化學修復技術相比，微生物修復技術因其修復效果好、操作簡便、費用低、降解過程迅速和無二次污染等特點，被廣泛采用。微生物修復技術的本質(zhì)是通過微生物的代謝活動將污染物降解，修復過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。

　　相比于正交設計，均勻設計的主要優(yōu)勢是：在因素和水平數(shù)均較多的情況下，用較少的實驗次數(shù)就可獲得期望的結(jié)果，節(jié)省人力和物力，便于實施。目前，國內(nèi)還少見將均勻設計法用于石油污染土壤微生物修復技術的研究報道。本工作采用從東營石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對模擬石油污染土壤進行微生物修復。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并進一步從理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量方面比較了土壤經(jīng)微生物修復前后的變化，為東營石油污染土壤微生物修復的現(xiàn)場應用提供了技術參考和理論支持。

　　1、實驗部分

　　1.1 材料、試劑和儀器

　　原油：山東省東營市某煉油廠；土壤：山東省東營市東營未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經(jīng)破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質(zhì)量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲存在滅菌牛皮紙袋內(nèi)冷藏備用。

　　LB培養(yǎng)基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節(jié)細菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實驗室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。

　　PHS-3型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；

　　721型可見光分光光度計：北京光學儀器廠。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1  4種單菌與土著微生物石油降解率的比較

　　采用LB培養(yǎng)基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對照樣考察土著微生物的修復作用。每間隔一段時間取樣，采用重量法測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。

　　1.2.2 優(yōu)勢菌群的構建和最佳配比的確定

　　對4種菌進行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率，從而構建出優(yōu)勢菌群。采用均勻設計法對優(yōu)勢菌群的配比進行優(yōu)化。

　　1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗選取

　　5個影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設計考察各因素對修復效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定方法

　　采用電位法測定土樣pH，水與土的體積比為2.5；重鉻酸鉀容量法測定模擬土樣的有機質(zhì)含量；半微量凱氏法測定模擬土樣的總氮含量；鉬銻抗比色法測定模擬土樣的總磷含量。

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