盤點2017 | 神器——冷凍電鏡“亂入”材料圈？

說起冷凍電鏡，小編想不管是研究生還是教授大咖，可能和科研有那么一丁點聯(lián)系的人對這個名字都不會陌生，因為它實在太出名了！基于冷凍電鏡產(chǎn)出的科研成果很多都發(fā)表在Nature、Science、Cell等頂刊上（羨慕臉），堪稱NSC神器。冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展直接帶動了生命科學(xué)領(lǐng)域，特別是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的飛速發(fā)展，今年更是不負(fù)眾望（欺負(fù)我大化學(xué)）一舉拿下了“炸藥”化學(xué)獎！不過，這些都不重要，畢竟他是隔壁生物家的孩子，以路人甲的姿態(tài)（羨慕但是我不表現(xiàn)出來）看看就好，反正也用不上！沒想到一個晴朗的日子，還有些風(fēng)和日麗的，Stanford的崔大神（崔屹）硬生生把它拽進了我大材料圈，而且一鳴驚人，搞了篇Science?。ň蛦柲惴环┞牭竭@個消息，小編不禁陷入了深深的沉思，都是做材料的，怎么差別就這么大呢？（隔壁桌小林人家是大牛！年輕的大牛！你，呵呵～）然而，短暫的沉思之后，小編知恥而后勇，決定好好看看這個“亂入”我材料圈的隔壁生物家的孩子，萬一大老板某天心血來潮也弄了一臺放實驗室了（大老板我就呵呵不說話），那小編豈不是有大大的優(yōu)勢，機智如我！獨機智不如眾機智，所以下面，小編帶大家共同了解一下這把生物圈的屠龍寶刀——冷凍電鏡！

1． 什么是冷凍電鏡？

冷凍電鏡，全稱冷凍電子顯微鏡技術(shù)（Cryo－electron microscopy， Cryo－EM）（我大材料的小伙伴也快好好記住這個單詞，相信不就的將來就會成為檢索材料學(xué)文獻的熱門關(guān)鍵詞），是指將生物大分子快速冷凍后，在低溫環(huán)境下利用透射電子顯微鏡對樣品進行成像，再經(jīng)圖像處理和重構(gòu)計算獲得樣品三維結(jié)構(gòu)的方法［1］。圖1就是中科院生物物理研究所的FEI Titan Krios 300kV冷凍電鏡，據(jù)說單臺應(yīng)該在600萬美元以上。經(jīng)過30多年的發(fā)展，冷凍電鏡甚至超越了X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）支撐起了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。

圖1 FEI Titan Kiros 300kV 冷凍電鏡實物圖

那么為什么需要冷凍電鏡技術(shù)？眾所周知，X射線晶體學(xué)是解析結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法，然而它需要獲得生物樣品單晶，生物大分子的晶體生長卻十分困難；而與此同時，材料學(xué)研究中早已使用電鏡直接觀察到了原子像［2］（作為一名材料汪，TEM、SEM的重要性我想無需贅言），于是生物學(xué)家也想用電鏡給生物大分子拍一張高清照片，解析其結(jié)構(gòu)，以理解其生化反應(yīng)機制，然而事情沒有那么簡單，電子顯微鏡在生物領(lǐng)域的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制（1）生物樣品含有豐富的水，而透射電鏡的工作條件是高度真空的；（2）高能電子束會嚴(yán)重破壞生物樣品；（3）生物樣品主要是C、O、N、H等輕元素，對電子的反射和散射與背景相似，獲得圖像襯度很低；（4）蛋白質(zhì)分子會漂移，導(dǎo)致圖像模糊。經(jīng)過眾多科學(xué)家的長期努力，不斷克服種種困難，冷凍電鏡技術(shù)終于發(fā)展了起來，實現(xiàn)了溶液里生物分子高分辨率的結(jié)構(gòu)解析，使得生物化學(xué)進入了一個新時代，其中3位有開創(chuàng)性貢獻的科學(xué)家因此榮膺2017年諾貝爾化學(xué)獎。他們分別是瑞士洛桑大學(xué)Jacques Dubochet教授、美國哥倫比亞大學(xué)Joachim Frank教授和英國劍橋大學(xué)Richard Henderson教授。冷凍電鏡技術(shù)給出的生物大分子高清照相的方案是［1］樣品冷凍→低劑量電子冷凍成像→三維重構(gòu)。

圖2 獲得2017年諾貝爾化學(xué)獎的3位科學(xué)家

（1）樣品冷凍

樣品冷凍其實是科學(xué)家們很早就想到的思路，但是冷凍之后樣品中水分子形成冰晶，不僅產(chǎn)生強烈電子衍射掩蓋樣品信號，還會改變樣品結(jié)構(gòu)。直到1974年，Kenneth A． Taylor和Robert M． Glaeser在－120℃觀察含水生物樣品時未發(fā)現(xiàn)冰晶形成，而且發(fā)現(xiàn)冷凍樣品能夠耐受更大劑量和更長時間的電子輻照，才為樣品冷凍帶來轉(zhuǎn)機。而上面提到的Jacques Dubochet老爺子則更進一步，發(fā)現(xiàn)了水的玻璃態(tài)，成功解決了冷凍電鏡制樣問題，如圖3 （a）所示［1］。

圖3 冷凍電鏡樣品制備（a）和三維重構(gòu)（b）示意圖

（2）低劑量電子冷凍成像

材料汪都知道一般做TEM、SEM的時候，樣品導(dǎo)電性越好，電子劑量越高，成像質(zhì)量越好。然而，高劑量電子對生物大分子卻是毀滅性的，因此Richard Henderson教授提出在低溫下用盡量低的電子劑量成像。他與其合作者先后在1975年和1990年重構(gòu)出了粗糙的（7?）和高分辨率（3．5?）的細菌視紫紅質(zhì)蛋白的模型，如圖4所示，證明了冷凍電鏡用于生物大分子高分辨率結(jié)構(gòu)解析的可行性。然而，這個歷時15年的進步與早在1984年就獲得膜蛋白3．0 ?分辨率原子模型的Hartmut Michel等人（1988年諾貝爾化學(xué)獎獲得者）相比似乎仍顯遜色。盡管情況不容樂觀，但是Henderson教授仍不斷從理論上指導(dǎo)冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展并預(yù)言隨著電鏡技術(shù)和制樣水平的發(fā)展，冷凍電鏡必將成為疑難樣品和非結(jié)晶生物大分子結(jié)構(gòu)解析的有力工具。

圖4 細菌視紫紅質(zhì)蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型

（3）三維重構(gòu)

做過TEM的小伙伴都知道，透射電鏡得到的是二維投影圖像，要得到三維的結(jié)構(gòu)，就要通過一系列建模、變換，這個過程就是三維重構(gòu)。上面提到的第3位諾獎得主Joachim Frank就是和他的合作者建立了非對稱顆粒從二維投影到三維結(jié)構(gòu)的方法（隨機圓錐傾斜法），奠定了冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)的基本原理，如圖3（b）所示［3， 4］。隨后，開發(fā)了SPIDER程序用于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析，得到了廣泛應(yīng)用。目前，冷凍電鏡領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的三維重構(gòu)軟件是上面劍橋大學(xué)Richard Henderson老爺子實驗室的Sjors Scheres博士（據(jù)說當(dāng)時Sjors Scheres博士沒有一篇NSC論文，但Richard Henderson教授仍獨具慧眼將其引進到劍橋MRC分子生物學(xué)實驗室）開發(fā)的RELLION。

然而，即便打通了任督二脈（上述3個關(guān)鍵流程），冷凍電鏡并沒有立即獲得今天這樣的爆紅。這主要是因為（1）冷凍電鏡的信噪比低，（2）圖像攝取時漂移，使得可以獲取的二維投影仍是模糊狀態(tài)，因此僅能應(yīng)用于有限的生物大分子單顆粒的結(jié)構(gòu)解析，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。直到2013年，加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的程亦凡教授等將直接電子探測器（DDD）用于記錄冷凍電鏡的單顆粒圖像，大大提高了信噪比與分辨率，實現(xiàn)了近原子分辨率（3．3 ?）的膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析，才引起了業(yè)界的轟動，如圖5所示。隨后，冷凍電鏡技術(shù)在生物大分子3D結(jié)構(gòu)解析中無往不利，堪稱屠龍寶刀。目前，美國NIH的Subramaniam實驗室成功解析了谷氨酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)，分辨率達到了1．8 ?，創(chuàng)造了最高分辨率的世界紀(jì)錄。

圖5 直接電子探測器應(yīng)用前后的分辨率對比

可見，正是3位諾獎科學(xué)家在各自領(lǐng)域內(nèi)完成突破性的工作Jacques Dubochet突破了冷凍技術(shù)的瓶頸，Joachim Frank在三維重構(gòu)算法上做出了原創(chuàng)性貢獻，Richard Henderson首次使用低電子劑量成像完成了生物大分子3D結(jié)構(gòu)的解析并一直在理論上指導(dǎo)冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，最終形成了0到1的飛躍，鑄造了冷凍電鏡這一把屠龍寶刀，開創(chuàng)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的新局面。上述3位科學(xué)家獲得諾貝爾獎?wù)驴梢哉f當(dāng)之無愧！

2．冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的戰(zhàn)績

從NSC等頂刊的發(fā)文情況及源源不斷的生物大分子結(jié)構(gòu)被解析出來，冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域取得的巨大成功無需贅述。單單以中國大陸為例，基于冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域取得的重大進展就十分可觀，具體如表1所示［5］（2016年）。而隨著冷凍電鏡技術(shù)的大熱，國內(nèi)的許多高校、科研院所紛紛花重金購進冷凍電鏡設(shè)備，已經(jīng)有超過24家獨立實驗室在采用冷凍電鏡進行蛋白質(zhì)等生物大分子的3D結(jié)構(gòu)解析研究，如圖6所示［5］。

表1 2016年中國大陸基于冷凍電鏡取得的標(biāo)志性成果

圖6 國內(nèi)主要的冷凍電鏡分布圖

3．冷凍電鏡在材料科學(xué)中嶄露頭角

小編沒有查到在崔屹教授之前將冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用到材料科學(xué)領(lǐng)域的報道，但是不管有沒有，以Stanford的崔屹教授2017年10月27日在線發(fā)表在Science這篇題為“Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo－electron microscopy”的研究論文 ［6］作為冷凍電鏡在材料學(xué)研究中的一個開端，小編認(rèn)為是合適的，畢竟它是“他山之石，可以攻玉”的一個典范，可以說開啟了材料科學(xué)研究的一個新世界。

做鋰電的小伙伴都知道，鋰枝晶是鋰電中最大的安全隱患，Samsung、Apple產(chǎn)品時不時出現(xiàn)的自燃事故和它不無關(guān)系。時至今日，枝晶的產(chǎn)生、生長以及刺穿隔膜造成電池內(nèi)部短路，都是電池專家們不得不直面的問題，也是材料領(lǐng)域“持續(xù)高溫”的研究方向。然而，眾所周知，鋰元素非?；顫?，對環(huán)境極其敏感，如何從原子層面去研究鋰枝晶的形成和生長，極具挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的高分辨TEM電子束能量很高，會嚴(yán)重?fù)p壞枝晶結(jié)構(gòu)甚至熔毀；而低分辨的TEM、直接成像、表面探針等技術(shù)獲得的信息又十分有限。在這篇Science論文中，崔屹教授等受“冷凍電鏡可以獲得脆弱的生物大分子原子級別結(jié)構(gòu)”的啟發(fā)，創(chuàng)造性地將冷凍電鏡技術(shù)引入到了敏感性電池材料和界面精細結(jié)構(gòu)的研究中，克服了電池材料冷凍制樣的種種難題，首次獲得了鋰枝晶原子分辨率級別的結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果顯示，冷凍電鏡技術(shù)完整地保留了枝晶的原始形貌及相關(guān)結(jié)構(gòu)、化學(xué)信息，在持續(xù)10min的電子束轟擊下仍然保持完好。高分辨的Cryo－EM照片表明鋰枝晶是呈長條狀的完美六面晶體，完全迥異于傳統(tǒng)電鏡觀察到的不規(guī)則形狀；而其生長行為顯示其有明顯的＜111＞優(yōu)先取向，生長過程中可能發(fā)生“拐彎”，但是并沒有形成晶體缺陷，不影響其完美晶體結(jié)構(gòu)。另外，研究結(jié)果還包含固態(tài)電解質(zhì)界面（SEI）的組成與結(jié)構(gòu)。崔屹教授表示，研究結(jié)果十分令人興奮，證明了Cryo－EM可以有效地對那些脆弱、不穩(wěn)定的電池材料進行高分辨率表征，例如鋰硅、硫等，并且保持它們在真實電池中的原始狀態(tài)。

圖7 通過Cryo－EM保存和穩(wěn)定鋰金屬

小編在查閱文獻過程中，也發(fā)現(xiàn)了另一篇采用Cryo－EM研究鋰電池的論文“New Insights on the Structure of Electrochemically Deposited Lithium metal and Its Solid Electrolyte Interphases via Cryogenic TEM”，由美國加州大學(xué)圣地亞哥分校（UCSD）的孟穎教授（Ying Shirley Meng）等人發(fā)表在Nano Lett．上，發(fā)表時間為2017年11月1日，在線發(fā)表僅比崔教授的Science大作晚4天。文章［9］同樣是采取了冷凍電鏡技術(shù)穩(wěn)定了電化學(xué)沉積的活潑的鋰金屬，同時減少電子束帶來的損傷，然后對其納米結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成以及固態(tài)電解質(zhì)界面進行了研究。可以說和崔屹教授異曲同工，證明了Cryo－EM是研究對電子束、熱敏感的電池材料強有力的工具，能夠從最基礎(chǔ)的層面獲得相關(guān)信息。

圖8 Cryo－EM用于電沉積Li金屬的研究

除了上述兩篇將Cryo－EM用于鋰電池中敏感電池材料及SEI研究的論文外，就小編有限的認(rèn)知，可能在有機／無機雜化鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點等精細結(jié)構(gòu)、中間態(tài)的表征中，Cryo－EM將具有的優(yōu)勢也是不言而喻的?？梢灶A(yù)見，不久的將來，這些對電子束、熱敏感的活潑材料的原子級別的表征可能會是Cryo－EM在材料領(lǐng)域應(yīng)用的潛力方向。

4． 總結(jié)

2017年10月4日，諾貝爾化學(xué)獎一公布就引起了朋友圈的瘋狂調(diào)侃，認(rèn)為冷凍電鏡是授予物理學(xué)家的化學(xué)獎以獎勵他們對生物領(lǐng)域的杰出貢獻，讓眾多化學(xué)汪深以為然?，F(xiàn)在，崔屹教授的Science論文和孟穎教授的Nano Lett．論文終于讓這個化學(xué)獎多了一些化學(xué)的意思了。這種隔壁生物家的孩子“跨界”材料圈完成的令人興奮的工作已經(jīng)隱隱有撬動材料學(xué)相關(guān)研究的苗頭了。小編相信，這項引領(lǐng)生物化學(xué)研究進入新時代的技術(shù)，攪動我大材料江湖也是指日可期！

參考文獻

［1］ 楊慧， 李慎濤， 薛冰． 冷凍電鏡技術(shù) 從原子尺度看生命［J］． 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2017， 38（5） 770－776．

［2］ 柳正， 張景強． 結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法的重大突破——電子直接探測相機在冷凍電鏡中的應(yīng)用［J］． 生物物理學(xué)報， 2014， 30（6） 405－415．

［3］ 尹長城． 君欲善其事，必先利其器！——2017年諾貝爾化學(xué)獎評介［J］． 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報， 2017， 33（10） 979－984．

［4］ Milne J L S， Borgnia M J， Bartesaghi A， et al． Cryo－electron microscopy－a primer for the non－microscopist［J］． FEBS Journal， 2013， 280 28－45．

［5］ Wang H， Lei J， Shi Y． Biological cryo－electron microscopy in China［J］． Protein Science， 2017， 26 16－31．

［6］ Li Y， Li Y， Pei A， et al． Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo－electron microscopy［J］． Science， 2017， 358 506－510．

［7］ 材料牛 崔屹最新science玩轉(zhuǎn)冷凍電鏡——揭密電池材料和界面原子結(jié)構(gòu)，http／／www．cailiaoniu．com／108826．html．

［8］ X－MOL 化學(xué)諾獎冷凍電鏡再放異彩，崔屹團隊帶來重磅Science，http／／www．x－mol．com8081／news／9696．

［9］ Wang X， Zhang M， Alvarado J， et al． New Insights on the Structure of Electrochemically Deposited Lithium metal and Its Solid Electrolyte Interphases via Cryogenic TEM［J］． Nano Letter， 2017， 17 7606－7612．

本文由材料人編輯部納米學(xué)術(shù)組Roay供稿。