從土壤中分離一株能分泌纖維素水解酶的微生物質(zhì)分離方案

【專家解說】：1、土壤取樣 　　從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 2、制備培養(yǎng)基 　　準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。 3、微生物的培養(yǎng)與觀察 　　依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107至103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。 　　將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。 　　挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 4、細(xì)菌的計(jì)數(shù) 　　當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。 思考：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 　　這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（株/g）是不同的，因此，為了獲得不同類型的微生物，就需要不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。 （四）剛果紅染色法的原理 　　剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅——纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。 （五）分離土壤中纖維素分解菌的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下： 1、土樣采集 　　土樣采集的方法與上一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的類似。土樣的采集要在富含纖維素的環(huán)境中進(jìn)行，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境中，通常會(huì)聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個(gè)月左右也會(huì)有能分解纖維素的微生物生長。 2、選擇培養(yǎng) 　　選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250mL錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1mL和10mL的移液管、天平、搖床、溫度計(jì)等。 　　培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250mL錐形瓶中裝入30mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報(bào)紙），用線繩扎緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。 　　選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1～2d，至培養(yǎng)基變混濁。此時(shí)可以吸取0.1mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板，也可以重復(fù)選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。 3、剛果紅染色法分離纖維素分解菌 　　這一步所需要的儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1mL移液管，裝有9mL無菌水的20mL大試管，溫箱等。 　　培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。 　　倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作的要求，在無菌的培養(yǎng)皿中倒入15～20mL培養(yǎng)基，凝固后待用。 　　制備菌懸液：按照本專題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)至106。 　　涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30℃倒置培養(yǎng)，至菌落長出。每個(gè)稀釋度下需涂布3個(gè)平板，并注意設(shè)置對(duì)照。 　　剛果紅染色法： 　　常用的剛果紅染色法有兩種，一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。 　　方法一　在長出茵落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃度為1 mg／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物質(zhì)的量濃度為l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此時(shí)，產(chǎn)生纖維素酶的茵落周圍將會(huì)出現(xiàn)透明圈。 　　方法二　配制質(zhì)量濃度為10 mg／mI。的CR溶液，滅菌后，按照每200 mI。培養(yǎng)基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混勻后倒平板。等培養(yǎng)基上長出茵落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)明顯的透明圈