什么是微生物培養(yǎng)技術(shù)?

【專家解說(shuō)】：“微生物的利用”包括“進(jìn)行微生物的分離和培養(yǎng)”、“測(cè)定某種微生物的數(shù)量”、“研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用”和“嘗試?yán)梦⑸镞M(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)特定的產(chǎn)物”四項(xiàng)具體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)，按照相關(guān)內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)的要求，結(jié)合人教版教材所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)課題，本文將談?wù)剬?duì)本專題的教學(xué)組織。 1 習(xí)得微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能 本專題涉及三個(gè)實(shí)驗(yàn)課題，它們的關(guān)系及學(xué)習(xí)要求如下圖所示。在下圖中，課題1涉及微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)和基本的操作技能，是其他兩個(gè)課題的基礎(chǔ)，課題2和課題3涉及特定的微生物的分離、計(jì)數(shù)和鑒定，難度較大，課題2強(qiáng)調(diào)選擇性培養(yǎng)基的配制和作用，課題3是在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，又相應(yīng)地增加了鑒別性培養(yǎng)基的知識(shí)及其應(yīng)用。 1.1 配制微生物培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)是培養(yǎng)、觀察和研究微生物的基礎(chǔ)。教學(xué)時(shí)，可以先展示有菌落生長(zhǎng)的培養(yǎng)基平板，給學(xué)生以視覺(jué)刺激，讓他們體會(huì)到要觀察和研究微生物，必須創(chuàng)設(shè)一定的條件讓微生物大量快速地繁殖起來(lái)，只有形成具有一定特征的菌落，才能更好地研究微生物。進(jìn)而向?qū)W生提供幾種微生物培養(yǎng)基的配方，讓學(xué)生通過(guò)比較分析各種配養(yǎng)基配方，明確微生物培養(yǎng)基的基本成分包括:碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水，有些微生物還需要某些特殊的生長(zhǎng)因子。然后，依次闡明固體、半固體和液體培養(yǎng)基的用途和配制方法，并結(jié)合下面的流程圖概述培養(yǎng)基配制的操作步驟: 組織學(xué)生配制微生物培養(yǎng)基時(shí)，要向他們講清下列注意事項(xiàng):(1)溶化瓊脂時(shí)要控制火力的大小并不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦;(2)加熱過(guò)程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度;(3)分裝至試管時(shí)培養(yǎng)基的高度不要超過(guò)試管高度的1/5;(4)一般是培養(yǎng)基先滅菌再倒平板，也可先倒平板,課間再滅菌;(5)冷卻后的平板要倒置，以確保拿放方便，同時(shí)避免水分蒸發(fā)，以利微生物生長(zhǎng)。 1.2 無(wú)菌技術(shù)操作無(wú)菌技術(shù)是培養(yǎng)、分離和純化微生物的重要技術(shù)手段，也是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵性操作。教學(xué)時(shí)，要先讓學(xué)生正確區(qū)分消毒和滅菌這兩個(gè)概念，并充分認(rèn)識(shí)無(wú)菌操作的重要性;然后，在教師的組織和指導(dǎo)下進(jìn)行規(guī)范、熟練地操作，以便順利完成微生物的培養(yǎng)、分離和純化等實(shí)驗(yàn)。下表是消毒和滅菌的一些常用方法及使用范圍。 定義 常用方法 微生物培養(yǎng)和組培的應(yīng)用 消毒 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分菌體,但不傷及活組織 煮沸 玻璃儀器 紫外線 實(shí)驗(yàn)室、操作臺(tái)、衣物等 酒精溶液 手、外植體等 次氯酸鈉溶液等 外植體 滅菌 使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有菌體、芽孢和孢子 高壓蒸汽 培養(yǎng)基、玻璃儀器、棉塞、牛皮紙等 灼燒 接種環(huán)、涂布器等 干熱 玻璃儀器 1.2.1 接種的方法及作用 微生物接種方法有兩種，一是劃線接種，即用接種環(huán)劃線將菌體沾在斜面培養(yǎng)基或平板培養(yǎng)基上。微生物的生長(zhǎng)和繁殖迅速，一段時(shí)間后，就會(huì)在培養(yǎng)基表面形成長(zhǎng)滿菌落的細(xì)線。劃線法的作用是純化微生物，通過(guò)劃線將微生物單個(gè)地分離，并最終形成標(biāo)準(zhǔn)的菌落;二是涂布接種，即用涂布器將稀釋菌液均勻地涂布在平板上。一個(gè)菌體在培養(yǎng)基平板上形成一個(gè)菌落，通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)可以計(jì)算樣品中的菌體數(shù)目。 1.2.2 規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作 接種過(guò)程的無(wú)菌操作是微生物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，右圖為劃線接種的操作示意圖，下表列出劃線接種的基本步驟和說(shuō)明。教學(xué)中，要求學(xué)生認(rèn)真領(lǐng)會(huì)無(wú)菌接種的技術(shù)原理，反復(fù)練習(xí)操步驟作。通過(guò)練習(xí)達(dá)到熟練程度，并培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的科學(xué)精神和一絲不茍的實(shí)驗(yàn)態(tài)度。 序列 操作步驟 分析說(shuō)明 1 將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅 將接種環(huán)滅菌，避免污染菌種 2 在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔除盛有菌液的試管棉塞 避免雜菌污染菌種 3 將試管口通過(guò)火焰 灼燒滅菌，防止試管口菌體污染培養(yǎng)基 4 將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取菌液 冷卻接種環(huán)可避免殺死菌種 5 將試管口通過(guò)火焰，并塞上棉塞 避免試管口雜菌污染菌種 6 左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基 初步接種。劃破培養(yǎng)基不利于后續(xù)的繼續(xù)劃線，長(zhǎng)出的菌落不標(biāo)準(zhǔn) 7 灼燒接種環(huán)，冷卻后從第一區(qū)劃線的末端向第二區(qū)劃線。重復(fù)以上操作，在第三、四、五區(qū)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連 從上個(gè)區(qū)域的末端向下個(gè)區(qū)域劃線,可逐步分離出單個(gè)菌體，從而實(shí)現(xiàn)微生物的純化 8 將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 倒置平板防止水分蒸發(fā)，也方便拿放 1.3 稀釋菌液的意義和操作方法 在單位體積的菌體培養(yǎng)液內(nèi)，含有的微生物個(gè)體數(shù)目很多。要對(duì)微生物進(jìn)行分離和計(jì)數(shù)必須將菌液稀釋，只有在稀釋度足夠高的菌液里，聚集的微生物才能分散成單個(gè)細(xì)胞。一般將菌液稀釋到10-3~10-7時(shí)，接種后可能在培養(yǎng)基平板上形成30~300個(gè)左右的菌落，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)也比較準(zhǔn)確可信。 用移液管和無(wú)菌水稀釋微生物菌液是一件要求較高的操作技術(shù)，學(xué)生需要經(jīng)過(guò)多次練習(xí)才能做到盡量地減少誤差。 以土壤為樣品進(jìn)行稀釋操作的注意事項(xiàng)是:(1)初次稱量的土壤樣品，稀釋后的菌液濃度較大，移液時(shí)極容易堵塞移液管或吸入較多的土壤顆粒，應(yīng)靜置一段時(shí)間后再移液，或者用低速離心機(jī)離心1分鐘后進(jìn)行移液;(2)當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，在稀釋前一定要震蕩試管，充分混合菌液，保證移液操作的準(zhǔn)確性;(3)每次移液前一定要注意用無(wú)菌水(或蒸餾水)清洗移液管并用氣球吹干，以保證移走菌液的濃度與試管中的一致。 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力的訓(xùn)練 2.1 選擇性培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)功能的不同，培養(yǎng)基分為選擇性 培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基，在“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”的實(shí)驗(yàn)中，先讓學(xué)生通過(guò)分析和判斷下面的三個(gè)培養(yǎng)基配方，真正理解選擇性培養(yǎng)基的含義。然后，啟發(fā)學(xué)生設(shè)計(jì)一組用于分離尿素細(xì)菌的探究實(shí)驗(yàn)，幫助學(xué)生理解選擇性培養(yǎng)基的特性及作用。 組別 培養(yǎng)基類型 是否涂布接種 目的 實(shí)驗(yàn)組 以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基 是 分離尿素細(xì)菌 對(duì)照組 牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基 是 判斷該培養(yǎng)基有無(wú)選擇性 2.2 鑒別性培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在“分解纖維素的微生物的分離”實(shí)驗(yàn)中，要鑒別篩選出來(lái)的微生物是不是分解纖維素的微生物，就必須用鑒別性培養(yǎng)基。剛果紅與纖維素等多糖類物質(zhì)反應(yīng)形成紅色復(fù)合物，添加剛果紅的培養(yǎng)基呈紅色，接種的微生物若能夠分解纖維素，就會(huì)在其菌落的周圍形成透明圈。值得注意的，培養(yǎng)基的瓊脂中含有淀粉類物質(zhì)，產(chǎn)生淀粉酶的微生物在培養(yǎng)基上也會(huì)形成透明圈;也有些微生物具有降解剛果紅的能力，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)在菌落周圍出現(xiàn)透明圈。與分解纖維素形成的透明圈相比，這兩種透明圈小而模糊，因此，本實(shí)驗(yàn)最好先用選擇性培養(yǎng)基篩選分解纖維素的微生物，再配制鑒別性培養(yǎng)基進(jìn)行“分解纖維素的微生物的分離”的實(shí)驗(yàn)。 3 教學(xué)實(shí)施的前期準(zhǔn)備 3.1提前準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備和藥品 為方便大家提前做好準(zhǔn)備，現(xiàn)以人教版教材為例，將本專題所需要的儀器、設(shè)備和藥品列表如下: 課題名稱 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 實(shí)驗(yàn)試劑或藥品 說(shuō)明 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶、量筒、酒精燈、電子天秤、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、接種環(huán)、涂布器、恒溫箱、干熱滅菌箱、小鐵鏟等 牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、瓊脂等 干熱滅菌箱能夠迅速地將洗干凈的培養(yǎng)皿和試管烘干，小鐵鏟用于鏟土 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 除配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基所需物質(zhì)外，增加KH2PO4 、NaHPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、酚紅等 分解纖維素的微生物的分離 除配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基所需物質(zhì)外，增加纖維素、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、KCl、酵母膏、水解酪素、CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)、土豆汁、剛果紅等 3.2 做好課時(shí)安排及計(jì)劃 以下為本專題的三個(gè)課題的課題數(shù)及其說(shuō)明。 課題名稱 課時(shí)數(shù) 說(shuō)明 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 4 配養(yǎng)基的基本知識(shí)及配制方法1;配制培養(yǎng)基及倒平板1;純化大腸桿菌和涂布接種1，觀察分析1 分離土壤中分解尿素的細(xì)菌 3 基本原理及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1;樣品稀釋及涂布接種1;對(duì)菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及實(shí)驗(yàn)的分析與討論1;在第二和第三課時(shí)之間需要間隔2天時(shí)間 分解纖維素的微生物的分離 3 基本原理及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1;樣品稀釋及涂布接種1;對(duì)菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及實(shí)驗(yàn)的分析與討論1;在第二和第三課時(shí)之間需要間隔2天時(shí)間 3.3 安排好教學(xué)班的實(shí)驗(yàn)順序 微生物實(shí)驗(yàn)涉及較多的實(shí)驗(yàn)儀器，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)需要課內(nèi)和課外相結(jié)合，如實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)需要學(xué)生在課堂上完成兩項(xiàng)重要的操作步驟，一是配制培養(yǎng)基并倒平板;二是接種操作。平板滅菌工作由于需要較長(zhǎng)的時(shí)間，因此只能由教師在課間完成。為保證每位學(xué)生都能親手操作，保證各個(gè)教學(xué)班能在有限時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)，教師可采取如下的教學(xué)流程和教學(xué)安排。 3.4 做好課后的觀察與記錄 配制培養(yǎng)基和接種操作可以在課堂上完成，但接種后的平板放入培養(yǎng)箱中需要培養(yǎng)2~3天，這期間可安排生物科代表或部分小組長(zhǎng)進(jìn)行定期觀察，并做好計(jì)錄，以便及時(shí)讓其他學(xué)生觀察到自己的實(shí)驗(yàn)成果。特別需要說(shuō)明的是，如果學(xué)生不能及時(shí)觀察，培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，很多菌落就會(huì)聯(lián)成一片，計(jì)數(shù)時(shí)就無(wú)法做到準(zhǔn)確有效。 4.實(shí)驗(yàn)中需要注意的安全操作 微生物本身就是危險(xiǎn)生物，實(shí)驗(yàn)操作中又涉及到消毒、滅菌和接種等基本環(huán)節(jié)，因此要對(duì)學(xué)生進(jìn)行安全教育，確保學(xué)生的安全和實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。一是操作安全，接種時(shí)要注意避免手被酒精燈火焰灼傷，接種后要及時(shí)提配學(xué)生洗手，以防止被微生物感染;二是環(huán)境安全，使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。