如何進行顆粒性抗原的制備

【專家解說】：一)凝集反應(yīng)(agglutination) 指顆粒性抗原(細菌、細胞等)與相應(yīng)的抗體，或可溶性抗原(亦可用抗體)吸附于與免疫無關(guān)的載體形成致敏顆粒(免疫微球)與相應(yīng)的抗體(或抗原)，在有適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集小塊。1.直接凝集反應(yīng)(direct agglutination) 是顆粒性抗原又稱凝集原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所呈現(xiàn)的凝集現(xiàn)象，如紅細胞和細菌凝集試驗。主要有玻片法、試管法及微量凝集法。玻片法為定性試驗，方法簡便快速，常用已知抗體檢測未知抗原，應(yīng)用于菌種鑒定，分型及人紅細胞ABO血型測定等；試管法通常為半定量試驗，常用已知抗原檢測待檢血清中有無相應(yīng)抗體及其相對含量，以幫助臨床診斷和分析病情。例如臨床實驗室常用的診斷傷寒或副傷寒的肥達氏試驗(Widal test)；診斷布魯氏菌病的瑞特氏實驗(Wrig test)及診斷斑疹傷寒及恙蟲病的外裴二氏試驗(Weil felix test)等。2.間接凝集反應(yīng)(indirect passive agglutination) 是可溶性抗原或抗體吸附于與免疫無關(guān)的微球載體上，形成致敏載體(免疫微球)，與相應(yīng)的抗體或抗原在電解質(zhì)存在的條件下進行反應(yīng)，產(chǎn)生凝集，稱為間接凝集或被動凝集；實驗室常用的載體微球有人O型血紅細胞、綿羊或家兔紅細胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭等，根據(jù)應(yīng)用的載體種類不同，分別稱為間接血凝、間接乳膠凝集及間接炭凝試驗等。本試驗主要用于某些傳染病如鉤端螺旋體抗原和原發(fā)性肝癌的早期診斷。間接凝集反應(yīng)擴大了凝集反應(yīng)的應(yīng)用范圍，其發(fā)展取決于載體，修飾載體使其帶有化學(xué)活性基團，或選用吸附力強、穩(wěn)定性高和帶有色素的載體，必將演化出新的方法。3.間接凝集抑制試驗(indirect agglutination inhibition test) 將可溶性抗原與相應(yīng)抗體預(yù)先混合并充分作用后，再加入抗原致敏的載體，此時因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，阻斷了抗體與致敏載體上的抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集抑制試驗。臨床常用的免疫妊娠試驗(immune pregnancy test)即屬此類。若以紅細胞作為載體則稱為間接血凝抑制試驗。所有上述凝集試驗均可劃分為正向和反向凝集試驗，以已知抗原測抗體的凝集試驗為正向凝集試驗，通?！罢颉眱勺质÷?，反之，為反向凝集試驗。4.協(xié)同凝集試驗(co-agglutination) 以金黃色葡萄球菌為載體，利用其細胞壁中的A蛋白(SPA)具有結(jié)合人及多種哺乳動物IgG Fc段的特性。將特異性抗體結(jié)合至金黃色葡萄球菌菌體，其Fab段暴露于菌體表面，遇到相應(yīng)抗原時與之結(jié)合，即可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌凝集(圖18.2)。稱為協(xié)同凝集試驗。常用于早期診斷流腦、傷寒、菌痢及布魯氏菌病。5.抗人球蛋白試驗(anti-human globulin reaction) 機體受抗原刺激后，除可產(chǎn)生完全抗體外，在某些病人(先天性溶血性貧血)也可產(chǎn)生不完全抗體(IgG)，后者雖能與抗原結(jié)合，但不出現(xiàn)肉眼可見反應(yīng)現(xiàn)象。Coomb等把含有不完全抗體血清球蛋白注射到異種動物體內(nèi)，使其產(chǎn)生抗人球蛋白抗體，將該抗人球蛋白抗體加入到顆粒性抗原與相應(yīng)的不完全抗體復(fù)合物中，就能出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為抗人球蛋白試驗，又稱Coomb's試驗。主要用于檢測Rh抗體及布魯氏菌抗體。圖： 凝集試驗示意圖(二)沉淀反應(yīng)(precipitation)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有適量電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀現(xiàn)象，稱為沉淀反應(yīng)。參與反應(yīng)的抗原稱沉淀原(precipitinogen)，抗體稱沉淀素(precipitin)。沉淀原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等，由于其體積小，相對反應(yīng)面積大，故試驗時需對抗原進行稀釋，以避免后帶現(xiàn)象。應(yīng)用較早的沉淀反應(yīng)是環(huán)狀沉淀反應(yīng)(ring precipitaion)和絮狀沉淀反應(yīng)(flocculation precipitation)，因其敏感性不高，已被淘汰。目前應(yīng)用最多的沉淀反應(yīng)是Oudin建立的凝膠(瓊脂)沉淀反應(yīng)及其派生方法。1.單向瓊脂擴散(simple agar diffusion) 簡稱單擴，將特異性抗體與熔化的瓊脂混合均勻，使抗體均勻分布于瓊脂，然后澆制成瓊脂板，再按一定要求打孔并加入抗原，使抗原向孔周自由擴散，與板中的抗體形成沉淀圈。本法為定量試驗，沉淀圈的直徑與抗原濃度成正比。單擴常用于血清中免疫球蛋白、AFP等的定量測定。2.火箭電泳(rocket electrophoresis) 若在單向瓊脂擴散基礎(chǔ)上，加入抗原后，將瓊脂板置電場中，使抗原置于負(fù)極即向正極定向擴散，在與板中的抗體結(jié)合而形成錐形沉淀峰，形似火箭，故名火箭電泳。沉淀峰的高度與抗原濃度成正比。由于在電場作用下，促使帶負(fù)電荷多的抗原泳動，故火箭電泳需時短，可用于快速測定抗原含量，如在標(biāo)本中加入少量同位素標(biāo)記的抗原后，可作放射免疫自顯影，能檢出微量抗原。應(yīng)用范圍與單擴相似。3.雙向瓊脂擴散(double agar diffusion) 簡稱雙擴，先制備瓊脂板，再按要求打孔并分別加入抗原和抗體，使兩者同時在瓊脂板上擴散，若兩者對應(yīng)且比例合適，則在抗原和抗體兩孔之間形成白色沉淀線。一對相應(yīng)的抗原抗體只形成一條沉淀線，因此可根據(jù)沉淀線的數(shù)目推斷待測抗原液中有多少種抗原成分；根據(jù)沉淀線的吻合、相切或交叉形狀，可鑒定兩種抗原是完全相同、部分相同還是完全不同(圖18.4)。本法常用于定性測定抗原抗體，亦可用于判斷免疫血清的效價。圖： 雙向瓊脂擴散試驗4.對流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis) 若在雙擴基礎(chǔ)上加電泳，將抗原孔置負(fù)極端，抗體孔置正極端。由于抗原所帶的負(fù)電荷較抗體多，且抗原分子小于抗體，在電場中能夠克服電滲的作用而由負(fù)極泳向正極；抗體卻克服不了電滲作用，從正極向負(fù)極移動，二者形成對流，并在比例適宜處形成白色沉淀線，稱為對流電泳。因抗原抗體皆作定向運動，所以敏感性較雙擴為高。除上述方法外還有多種免疫沉淀分析技術(shù)，如區(qū)帶電泳和雙擴相結(jié)合的免疫電泳(immunoelectrophoresis)、區(qū)帶電泳與火箭電泳聯(lián)用的交叉免疫電泳(cross immunelec-trophoresis)，及免疫選擇電泳、免疫固定電泳等，分別應(yīng)用于復(fù)雜抗原成分的分析和骨髓瘤、冷球蛋白血癥等臨床疾病的輔助診斷。隨著精密儀器的研制成功，最近又建立了散射比濁、速率散射比濁等方法，使沉淀反應(yīng)技術(shù)更加敏感、精確和自動化。(三)補體結(jié)合試驗(complement fixation test，CFT)該試驗是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)，來檢測未知的抗原或抗體的血清學(xué)試驗。有五種成分參與，分為指示系統(tǒng)和待檢系統(tǒng)(已知抗原和未知抗體或已知抗體和未知抗原)。補體用新鮮豚鼠血清。方法是將已知的抗原或抗體與未知標(biāo)本(可能含相應(yīng)抗體或抗原)充分混合，再加入補體作用一段時間，最后加入指示系統(tǒng)。若待檢系統(tǒng)有相應(yīng)抗體或抗原，則能形成抗原抗體復(fù)合物，從而消耗了補體不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，此為陽性；相反，出現(xiàn)溶血則為陰性。補體結(jié)合試驗的影響因素較多，正式試驗前需對已知成分作一系列滴定，尤其是補體，應(yīng)選擇適宜的量參與反應(yīng)，避免假性結(jié)果。每次試驗尚需同時設(shè)立多種對照，以作為判斷結(jié)果可靠性的依據(jù)。該法對顆粒性或可溶性抗原均適用，臨床上常用于檢測某些病毒、立克次氏體和螺旋體感染者血清內(nèi)的中的抗體，亦可用于某些病毒的分型。(四)中和反應(yīng)(neutralization) 毒素、酶、激素或病毒等與其相應(yīng)的抗體結(jié)合后，導(dǎo)致生物活性的喪失，稱為中和反應(yīng)。常用的中和試驗有病毒中和試驗和毒素中和試驗。1.病毒中和試驗(virus neutralization) 是檢測抗病毒抗體(中和抗體)的中和試驗。當(dāng)機體感染病毒后，能產(chǎn)生特異性的抗病毒中和抗體，可使相應(yīng)的病毒失去毒力。將待檢血清與病毒懸液混合，接種于細胞培養(yǎng)，根據(jù)對細胞的保護效果判斷病毒是否已被中和，并計算出“中和指數(shù)”，即代表中和抗體效價。該試驗可將已知免疫血清用于病毒鑒定，或用已知病毒檢測患者血清內(nèi)的中和抗體，用于流行病學(xué)調(diào)查及病毒性疾病的診斷。2.毒素中和試驗(toxinneutralization) 抗鏈球菌溶血素O試驗(antistreptolysin O test)，簡稱抗“O”試驗，是體外的毒素抗毒素中和試驗。乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生溶解人或兔紅細胞的溶血素O，具有抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。當(dāng)該毒素與相應(yīng)抗體作用時，毒性被中和而失去溶血活性。試驗時，病人血清先與溶血素O混合，作用一定時間后加入人紅細胞，若不出現(xiàn)溶血表明待測血清中有相應(yīng)抗體(抗O)，即為陽性。本試驗可根據(jù)抗體的含量并結(jié)合臨床，幫助風(fēng)濕病等免疫相關(guān)性疾病活動期的診斷。由于健康人血清中也有一定量的抗體，其含量與地區(qū)、季節(jié)、年齡等因素有關(guān)，因此檢測到抗體并不一定表明疾病處于活動期。而當(dāng)效價高達500單位以上時，才有臨床意義。(五)免疫標(biāo)記技術(shù)為提高抗原和抗體檢測的敏感性，將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)，從而間接測出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、熒光素、放射性同位素、膠體金及電子致密物質(zhì)等。這種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)(immunolabelling technique)。免疫標(biāo)記不僅大大提高了試驗敏感性，若與光鏡或電鏡技術(shù)相結(jié)合，能對組織或細胞內(nèi)的待測物質(zhì)作精確定位，從而為基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究及診斷提供方便。免疫標(biāo)記技術(shù)大致分為兩大類：一類屬于免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemical technique)，用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原的定位。另一類稱為免疫測定(immunoassay)，用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測定。 免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic technique) 最早應(yīng)用的免疫酶技術(shù)是免疫酶組織化學(xué)染色，即用標(biāo)記的抗體與標(biāo)本中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)加入酶的底物時，在酶的作用下經(jīng)一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，借助光鏡作出定位判斷。目前，應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。該法特異性強，敏感性高，既可檢測抗體，又能測定可溶性抗原。主要方法及操作要領(lǐng)見圖18.5，除了圖示的兩種方法外，還有抗原競爭法，現(xiàn)較少應(yīng)用。ELISA常采用的酶為辣根過氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解則呈棕褐色，可目測或借助酶標(biāo)儀比色。ELISA為非均相免疫測定，另外還有均相法，在此不作介紹。圖：ELISA示意圖由于酶免疫測定無需特殊儀器和試劑，且操作簡便，利于普及。因此，在免疫標(biāo)記技術(shù)中，該法應(yīng)用最為廣泛，并在原有方法基礎(chǔ)上加以改良，使得眾多新的，更敏感的方法應(yīng)運而生。①生物素-親和素放大系統(tǒng)(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通過將酶標(biāo)記在生物素或親和素上，借助生物素與親和素的高度親力和生物素能與抗體結(jié)合的特點應(yīng)用于ELISA，顯著提高了檢測的敏感性。②雙表位ELISA(two-site ELISA)，其方法同雙抗體夾心法，只是將包被的抗體和酶標(biāo)抗體換成針對兩個不同抗原決定簇的單抗，用于檢測單抗的親和性及表位特異性，亦可用于標(biāo)本中抗原的快速檢測，即在試驗時可將待測抗原與酶標(biāo)單抗同時加入反應(yīng)體系，減少檢測步驟。③斑點免疫滲濾試驗(dot immunofiltration assay，DIFA)，其原理與ELISA相同，但以微孔膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜等)代替聚苯乙烯板作載體。試驗時，將包被有抗原或抗體的微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加的標(biāo)本、酶結(jié)合物、底物，分別進行洗滌，多余的標(biāo)本和酶標(biāo)抗體及洗滌液等可滲濾入吸水材料中，最后陽性標(biāo)本在膜上呈現(xiàn)著色斑點。④酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印漬法(enzyme linked immunoelectrotransferblot，ELIB)，該法將免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)與酶標(biāo)技術(shù)相結(jié)合，有利于分析和檢測更加復(fù)雜的抗原成分。ELIB分三階段進行。第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，先將抗原分成不同的區(qū)帶(肉眼不可見)；第二階段為轉(zhuǎn)移電泳，即將凝膠上的電泳區(qū)帶經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；第三階段為酶免疫定位，用特異性抗體和酶標(biāo)抗抗體作間接ELISA，結(jié)果陽性區(qū)帶呈顯色反應(yīng)。2.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence techniques) 該法是以熒光素，如異硫氰酸熒光素(fluorescence isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、羅丹明等標(biāo)記抗體或抗原，以檢測標(biāo)本中抗原或抗體的方法。免疫熒光技術(shù)也包括兩種基本類型，即熒光抗體染色(fluorescentantiboby technique)和熒光免疫測定(fluorescein immunoassay)。①熒光抗體染色：是用熒光抗體浸染可能含有抗原的細胞或組織切片，若有相應(yīng)抗原存在，則抗原與熒光抗體結(jié)合而使熒光素不被洗脫，在熒光顯微鏡下可見發(fā)光的物體，從而達到定位檢測目的，在基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)的研究及疾病的診斷等方面有著廣泛用途。根據(jù)熒光抗體的不同可分直接法和間接法，前者即用熒光標(biāo)記的第一抗體直接檢測標(biāo)本片上的抗原，如病毒及某些蛋白質(zhì)成分等；后者則在未標(biāo)記的相應(yīng)抗體(第一抗體)處理標(biāo)本片后，覆以熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體(第二抗體)，借此可檢測多種抗原與抗體。與直接法相比，間接法僅需標(biāo)記一種第二抗體即可適應(yīng)多種抗原抗體系統(tǒng)的檢測，且敏感性較高。②熒光免疫測定：本法與酶免疫測定一樣，可分均相和非均相法。均相法常利用熒光的某些特性，如熒光的激發(fā)、吸收、猝滅等設(shè)計試驗，無需作結(jié)合的與游離的標(biāo)記物分離。雙標(biāo)記法即為均相熒光免疫測定的一種類型，檢測試劑為FITC標(biāo)記的抗原和羅丹明標(biāo)記的抗體，當(dāng)兩種標(biāo)記物標(biāo)記的抗原和抗體特異性結(jié)合后使兩種熒光素靠近，由于FITC的發(fā)射光譜能被羅丹明吸收，從而使FITC的熒光明顯減弱。試驗時將可能含有抗原的標(biāo)本與兩種標(biāo)記物一起反應(yīng)，則能與FITC標(biāo)記的抗原競爭結(jié)合羅丹明標(biāo)記的抗體，從而減少羅丹明對FITC發(fā)射光譜的吸收。通過FITC熒光測定可推算出標(biāo)本中抗原的量，其與熒光強度成正比。非均相法限于實驗室條件、試劑和容器或載體的非特異性熒光干擾等，應(yīng)用不及ELISA廣泛。近年建立的時間分辨熒光免疫測定(time resoloved fluorescence immunoassay，TR-FIA)有很大改進，該法利用稀土金屬(銪、鋱等)的螯合物具有特長的熒光壽命，將其標(biāo)記抗體并延長測定時間，以使短命的非特異性熒光衰退，從而測得均一的長壽命稀土螯合物熒光。此外稀土螯合物的激發(fā)光吸收峰(340nm)與熒光發(fā)射峰(613nm)之間的差別顯著，也利于排除非特異熒光的干擾。目前已用于IgE等微量血清成分及激素和某些藥物水平的測定。3.放射免疫測定(radioimmunoassay，RIA) RIA是最敏感的免疫標(biāo)記技術(shù)，精確度高且易規(guī)格化和自動化。但由于放射性同位素有一定的危害性，使其臨床應(yīng)用受到一定限制。目前主要應(yīng)用于激素(如HCG、胰島素)和藥物濃度的檢測。①液相放射免疫分析：為經(jīng)典的放射性同位素標(biāo)記技術(shù)(radio-isotypelabeliingtechnique)，簡稱放射免疫分析。其原理是用已知的標(biāo)記抗原與標(biāo)本中可能存在的抗原競爭一定量的已知抗體，分別形成標(biāo)記的和無標(biāo)記的抗原抗體結(jié)合物。再經(jīng)某些途徑分離結(jié)合的(B)與游離的(F)標(biāo)記物，并根據(jù)測得的放射性強度，算出結(jié)合率［B/B+F］，此與標(biāo)本中抗原的量成反 New Roman'; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'">］，此與標(biāo)本中抗原的量成反比。試驗時除作標(biāo)本檢測外，還要以不同濃度的已知抗原參與反應(yīng)得到的數(shù)據(jù)繪制出競爭抑制曲線，作為定量分析的依據(jù)。液相放射免疫測定的另一類型是免疫放射測定(immunoradionmetricassay，IRMA)，試驗時受檢抗原與過量的標(biāo)記抗體反應(yīng)，然后加入固相的抗原免疫吸附劑，以結(jié)合游離的標(biāo)記抗體，經(jīng)離心后測定上清液中放射性強度，從而推算出標(biāo)本中抗原的含量。②固相放射免疫測定(solidphase radioimmunoassay，SPRIA)：其原理、方法和應(yīng)用與ELISA基本相同，區(qū)別在于標(biāo)記物和檢測儀。SPRIA的敏感性略高于ELISA。與RIA相比，該法既可用已知的標(biāo)記抗原測抗體，也可用已知的標(biāo)記抗體測抗原。主要應(yīng)用于特異性IgE的檢測。4.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)(immunologic colloidal gold signature，ICS) 膠體金是分散相粒子的金溶液，經(jīng)凝聚法制成的金溶膠顆粒表面帶有較多電荷，能吸附抗體形成金標(biāo)記的抗體。用這種金標(biāo)記抗體與組織或細胞標(biāo)本中的抗原反應(yīng)，借助顯微鏡觀察顏色分布即可定位、定性測定組織或細胞中的抗原。該法最早用于免疫膠體金標(biāo)記電鏡技術(shù)，利用膠體金顆粒高電子密度，經(jīng)襯染后對超微切片中的抗原作定量或定位研究。繼后又應(yīng)用于光鏡并根據(jù)金催化還原銀離子的原理，結(jié)合攝影技術(shù)以銀增強金標(biāo)抗體的可見性，建立了免疫金銀法(IGSS)。此外，若將熒光素吸附于膠體金，在熒光顯微鏡下作定向性分布及定位觀察熒光染色標(biāo)本，可增強熒光效果。膠體金標(biāo)記技術(shù)發(fā)展較快，如膠體金斑點滲濾試驗和膠體金斑點免疫層析試驗，尤其是后者檢測敏感度高，操作簡單，時間短，1～2分鐘即可出現(xiàn)結(jié)果，已應(yīng)用于HCG和HBV和兩對半的檢測。方法簡述如下(圖18.6)，試驗用的均為干試劑，多個試劑被組合在一狹長的試劑條上，條上端(A)和下端(B)分別為吸水性材料，膠體金標(biāo)記的特異性抗體干片粘貼在B的近D處，緊接著為硝酸纖維膜，其上有兩個反應(yīng)區(qū)域，測試區(qū)(T)包被有與待檢抗原相應(yīng)的特異性抗體，對照區(qū)(C)包被有對應(yīng)的抗IgG抗體(二抗)。測試時將試紙下端浸入液體標(biāo)本中，通過吸水材料虹吸作用吸引標(biāo)本液向上移動，經(jīng)過D處時如標(biāo)本中有與金標(biāo)抗體相應(yīng)的抗原，兩者即結(jié)合，膠體金顆粒發(fā)生聚集變?yōu)榧t色。反之則不發(fā)生變化。過剩膠體金標(biāo)記的抗體繼續(xù)向前，與對照區(qū)的二抗結(jié)合，出現(xiàn)紅色質(zhì)控條帶。