生物樣品中蛋白質的處理方法有哪些?

【專家解說】：① 鹽析法 一般來說，所有固體溶質都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程叫鹽析。在生化制備中,許多物質都可以用鹽析法進行沉淀分離，如蛋白質、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質沉淀最為常見，特別是在粗提階段。 鹽析法分為兩類，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現(xiàn)，用于后期進一步分離純化和結晶。 ② 有機溶劑沉淀法 　有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數，導致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，最后析出。該法優(yōu)點在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；3）在生化制備中應用比鹽析法廣泛。其缺點是對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進行。總體來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。 　　有機溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。 ③ 其他沉淀法 一．等電點沉淀法 兩性電解質分子上的凈電荷為零時溶解度最低，不同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。如工業(yè)上生產胰島素時，在粗提液中先調PH8.0去除堿性蛋白質，再調PH3.0去除酸性蛋白質。 利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。 不少蛋白質與金屬離子結合后，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調整PH值。 等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。 　　二．生成鹽復合物沉淀法 　　1．金屬復合鹽法 許多有機物質包括蛋白在內，在堿性溶液中帶負電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據有機物與它們之間的作用機制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類，如銅鋅鎘；親羧酸疏含氮化合物類，如概鎂鉛；親硫氫基化合物類，如汞銀鉛。 蛋白質-金屬離子復合物的重要性質是它們的溶解度對溶液的介電常數非常敏感，調整水溶液的介電常數（如加入有機溶劑），即可沉淀多種蛋白。 　　2． 有機鹽法 　　含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應，故用于制備蛋白質時，需采用較溫和的條件，有時還需加入一定的穩(wěn)定劑。 　　3．無機復合鹽法 　　如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。 　　以上鹽類復合物都具有很低的溶解度，極易沉淀析出。若沉淀為金屬復合鹽，可通以H2S使金屬變成 硫化物而除去，若為有機酸鹽或磷鎢酸鹽，則加入無機酸并用乙醚萃取，把有機酸和磷鎢酸等移入乙醚中除去，或用離子交換法除去。值得注意的是此類方法常使蛋白質發(fā)生不可逆沉淀，應用時必須謹慎。 　　 三． 選擇性變性沉淀 　　其原理是利用蛋白質、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達到分離提純的目的。 　　此方法可分為：1）利用表面活性劑(三氯乙酸)或有機溶劑引起變性；2）利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；3）酸堿變性。 　　四．非離子多聚物沉淀法 　　非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，最早用于提純免疫球蛋白、沉淀一些細菌和病毒，近年來逐漸廣泛應用于核酸和酶的分離提純。這類非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等，其中應用最多的是聚乙二醇。 用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有兩種方法：1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。此方法基于不同生物分子表面結構不同，有不同分配系數。并外加離子強度、PH值和溫度等影響，從而擴大分離效果。2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。該方法操作時先離心除去大懸浮顆粒，調整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時間，即形成沉淀。