有關(guān)現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)在生物或醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

【專家解說(shuō)】：免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 [ 2006-9-19 23:09:41 | By: fwfsdf234 ]一． 免疫組化技術(shù)的原理和優(yōu)點(diǎn) （一）免疫組化技術(shù)的基本原理 應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。 眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過(guò)氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。（二）免疫組織化學(xué)染色方法 按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。 按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。 按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。（三）幾種常用免疫組織化學(xué)方法的原理 1 免疫熒光方法 　　是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。 2 免疫酶標(biāo)方法 免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。 本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。 　　免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來(lái)越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬PAP法、ABC法、SP法等。 3 免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。（四）免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 　　1．特異性強(qiáng)　免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。 2．敏感性高　在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。 3．定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合　該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。二．免疫組化在病理診斷和研究中的作用 　　由于免疫組化具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等顯著特點(diǎn)，且能將形態(tài)研究與功能研究有機(jī)地結(jié)合在一起，所以，這門(mén)新技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的許多領(lǐng)域。 在病理學(xué)研究中，免疫組化技術(shù)的作用和意義更為重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術(shù)出現(xiàn)以前，對(duì)腫瘤的診斷和分類還局限于細(xì)胞水平，而引入免疫組化技術(shù)后，則使研究的深度提高到了生物化學(xué)水平、分子水平。近年來(lái)，伴隨基因探針研究而興起的核酸分子原位雜交技術(shù)也正在蓬勃發(fā)展，更使免疫組化如虎添翼，兩者相得益彰，將研究推進(jìn)到了基因水平。 （一）確定細(xì)胞類型 通過(guò)特定抗體標(biāo)記出細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原成分，以確定細(xì)胞類型。如角蛋白是上皮性標(biāo)記，前列腺特異性抗原僅見(jiàn)于前列腺上皮，甲狀腺球蛋白抗體是甲狀腺濾泡型癌的敏感標(biāo)記，而降鈣素抗體是甲狀腺髓樣癌的特有標(biāo)記。有些細(xì)胞（如表皮內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、淋巴結(jié)內(nèi)指突狀和樹(shù)突狀網(wǎng)織細(xì)胞）光鏡下不易辨認(rèn)，但免疫組化標(biāo)記（S-100蛋白等）能清楚顯示其形態(tài)。 （二）辨認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物 　　利用某些細(xì)胞產(chǎn)物為抗原制備的抗體，可作為相應(yīng)產(chǎn)物的特殊標(biāo)記，如內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的各種激素，大多數(shù)可用免疫組化技術(shù)標(biāo)記出來(lái)，據(jù)此可對(duì)內(nèi)分泌腫瘤作功能分類，檢測(cè)分泌異位激素的腫瘤等。 （三） 了解分化程度 大多數(shù)標(biāo)記物都有其特定的分布部位，如上皮細(xì)胞膜抗原（EMA）著色部位在細(xì)胞膜上，但差分化乳癌胞漿內(nèi)也可出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒；角蛋白的含量也與分化程度有關(guān)，低分化或未分化癌含量較低、染色較弱。 （四）鑒定病變性質(zhì) 通過(guò)標(biāo)記Ig輕鏈（κ、λ）可區(qū)分部分B細(xì)胞性淋巴瘤與B細(xì)胞反應(yīng)性增生，前者常表達(dá)單一的Ig輕鏈（κ+/λ+），后者常為多克隆Ig輕鏈（κ+、λ+）。而標(biāo)記bcl-2蛋白在區(qū)別濾泡型淋巴瘤和反應(yīng)性濾泡增生上有相當(dāng)?shù)囊饬x。在濾泡型淋巴瘤，90%以上腫瘤性濾泡細(xì)胞有bcl-2的高表達(dá)；而在濾泡反應(yīng)性增生時(shí)，濾泡反應(yīng)中心的細(xì)胞不表達(dá)bcl-2蛋白，而套細(xì)胞則表達(dá)。 （五）發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶 某些癌的早期轉(zhuǎn)移有時(shí)與淋巴結(jié)內(nèi)竇性組織細(xì)胞增生不易區(qū)別。用常規(guī)病理組織學(xué)方法要在一個(gè)組織中認(rèn)出單個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞是不可能的，而采用免疫組化方法（如用上皮性標(biāo)志）則十分有助于微?。ò┺D(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)。對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤也可借助免疫組化標(biāo)志尋找原發(fā)瘤，如骨組織內(nèi)有前列腺特異性抗原陽(yáng)性細(xì)胞，提示前列腺癌轉(zhuǎn)移。 （六）探討腫瘤起源或分化表型 一些來(lái)源不明的腫瘤長(zhǎng)期爭(zhēng)論不休，最后通過(guò)免疫組化標(biāo)記取得共識(shí)。如顆粒性肌母細(xì)胞瘤，曾被認(rèn)為是肌源性的，但該腫瘤肌源性標(biāo)記陰性，而神經(jīng)性標(biāo)記陽(yáng)性，證明為神經(jīng)來(lái)源（可能來(lái)自神經(jīng)鞘細(xì)胞）。分化很差的腫瘤病理上常按細(xì)胞形態(tài)分為梭形細(xì)胞腫瘤、小圓細(xì)胞腫瘤等，通過(guò)多種標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用，也可能確定來(lái)源。 （七）確定腫瘤分期 判斷腫瘤是原位還是浸潤(rùn)及有無(wú)血管、淋巴管侵襲與腫瘤分期密切相關(guān)。用常規(guī)病理方法判斷有時(shí)是十分困難的，但用免疫組化法可獲得明確結(jié)果。如采用層粘連蛋白和Ⅳ型膠原的單克隆抗體可清楚顯示基底膜的主要成分，一旦證實(shí)上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸潤(rùn)癌了，其預(yù)后是不同的。用第八因子相關(guān)蛋白、荊豆凝集素等顯示血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物則可清楚顯示腫瘤對(duì)血管或淋巴管的浸潤(rùn)。對(duì)許多腫瘤的良惡性鑒別及有無(wú)血管或淋巴管浸潤(rùn)，這是主要的鑒別依據(jù)，同時(shí)也有治療及預(yù)后意義。 （八）指導(dǎo)治療和預(yù)后 免疫組化標(biāo)記中與預(yù)后有關(guān)的標(biāo)記大致可分為三類：①類固醇激素受體：如雌激素受體、孕激素受體等，它們與乳腺癌的關(guān)系已獲公認(rèn)，性激素受體陽(yáng)性者內(nèi)分泌治療效果較好，預(yù)后也較好。相似的結(jié)果也見(jiàn)于子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。②腫瘤基因標(biāo)記：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在腫瘤中高度表達(dá)者，患者預(yù)后較差；而nm23蛋白高度表達(dá)者，腫瘤轉(zhuǎn)移率較低，預(yù)后較好。③細(xì)胞增殖性標(biāo)記：如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Ki-67等，表達(dá)指數(shù)越高，表明其增殖越活躍，惡性度增高，預(yù)后不良，其中以惡性淋巴瘤、乳腺癌較為明顯。而且在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Ki-67、 PCNA 、EGFR陽(yáng)性者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，并與激素受體的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 （九）輔助疾病診斷和分類 人體的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如腎小球腎炎、皮膚自身免疫性疾病等，可用免疫組化方法對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的免疫球蛋白、補(bǔ)體、免疫復(fù)合物等進(jìn)行檢測(cè)以輔助診斷。某些疾病的分類或分型也是在免疫組化基礎(chǔ)上建立的。內(nèi)分泌腫瘤如垂體前葉腺瘤，根據(jù)其分泌功能可分為生長(zhǎng)激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰島細(xì)胞瘤的功能分類為胰島素瘤、高血糖素瘤等6種；惡性淋巴瘤根據(jù)瘤細(xì)胞表面標(biāo)志不同可分為T(mén)細(xì)胞性、B細(xì)胞性。腎小球腎炎的免疫學(xué)分類亦需免疫組化或免疫熒光技術(shù)。 （十）尋找感染病因 人體疾病的致病微生物中有的在常規(guī)病理檢查中不易發(fā)現(xiàn)，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞水平上難以發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫組化方法則可明確發(fā)現(xiàn)病原體抗原部位以及定量，如巨細(xì)胞病毒（CMV）、人乳頭狀瘤病毒（HPV）、單純皰疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化標(biāo)志物幫助解決病因診斷問(wèn)題。