純化生物產(chǎn)品的得率是如何計算的

【專家解說】：生物藥物的提取純化技術(shù) 第一節(jié) 概述 一、生物藥物的特點(diǎn)及純化方法 許多生物藥物具有生物活性，其穩(wěn)定性受pH,一溫度、離子強(qiáng)終提取過程所使用的溶劑和表面活性劑、金屬離子等方面的嚴(yán)件物藥物對剪切力很敏感，分子量越大，其穩(wěn)定性就越差，在甘離純化過程中，條件就應(yīng)當(dāng)越溫和。一些組分的濃度非常低。但是生物藥物產(chǎn)品的純度卻要求很高，含量要達(dá)到95%甚至98%以上。結(jié)晶態(tài)產(chǎn)品最好，藥物還應(yīng)具有正常的顏色、穩(wěn)定性和溶解速率。 生物藥物的制備，如蛋白質(zhì)制備，涉及物理、化學(xué)和生物學(xué)知識。其主要原理有兩個方面:一是利用混合物中組分分配率差別，把它們分配于可機(jī)械分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等;二是將混合物置于單一物相中，經(jīng)物理力場作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)分離目的，如電泳、超離心、超濾等。相互分離主要利用蛋白間各種性質(zhì)的微小差別,諸如分子形狀、分子量大小、帶電性質(zhì)、溶解度、生物功能專一性等，制備方法可按這些主要因素進(jìn)行分類。按分子大小和形態(tài)分差速離心、超濾、分子篩及透析等方法;按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結(jié)晶等;按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析及吸附層析等;按生物功能專一性有親合層析法等。 蛋白分離純化比較困難。需要研究目的物質(zhì)的微細(xì)特征，巧妙聯(lián)用各種方法并進(jìn)行嚴(yán)密的操作，并有必要了解精制過程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白可利用吸收光譜等物理性質(zhì)或以相當(dāng)于單位氮活性增加進(jìn)行追蹤;其他蛋白可用電泳、超離心、層析、擴(kuò)散及溶解等測定純度;不穩(wěn)定蛋白，如分離SH-酶時，使用試劑及緩沖液等要確認(rèn)不含重金屬離子(特級試劑也需檢定)。 蛋白質(zhì)純化的操作如脫鹽、濃縮干燥等均與低分子物不同，須經(jīng)獨(dú)特的繁瑣操作。 提純蛋白和酶時?；煊泻怂峄蚨嗵?，一般可用專一性酶解、有機(jī)溶劑抽取及選擇性部分沉淀等法處理。小分子物質(zhì)常在制備中經(jīng)多次液相與固相轉(zhuǎn)化被分離或最后用透析法除去。而同類物質(zhì)分離，情況則復(fù)雜得多。主要采用鹽析、有機(jī)溶劑沉淀，等電點(diǎn)沉淀、吸附、結(jié)晶、電泳、超離心及柱層析法等。其中，鹽析、等電點(diǎn)及結(jié)晶法用于蛋白質(zhì)和酶的提純較多;有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核酸提純較多;柱層析、梯度離心對蛋白和核酸的提純應(yīng)用十分廣泛。 蛋白分離純化方法很多。 Bonnerjea 等人對有關(guān)蛋白和酶的分離純化方法及其特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)主要有10種方法，它們的出現(xiàn)頻率為: 離子交換 75% 親和過程 60% 沉 淀 57% 凝膠過濾 50% 其 它 <33% 目前尚無一種方法可用以純化各種蛋白質(zhì)，但每種蛋白質(zhì)都可設(shè)法分離純化。選擇純化方法，需要考慮到純度、活性、得率等。 二、提取純化的單元操作和基本工藝流程 生物藥物的提取和純化可分為5個主要步驟:預(yù)處理、固液尹離產(chǎn)縮、純化和產(chǎn)品定型(干燥，制丸，擠壓，造粒，制片)每一步驟都可采用各種單元操作。在提取純化過程中，要盡可能減少操作步驟，因?yàn)槊恳徊僮鞑襟E都不可避免帶來損失。操作步驟多，總收率就會下降。生物藥物提取工藝流程的基本模式如1-1所示。根據(jù)主要分離因素排列的單元分離范圍見圖1-2。 圖1-1 生物藥物提取工藝流程的基本模式 表1-1根據(jù)主要分離因素排列的單元分離范圍 三、提取純化單元操作技術(shù)的特點(diǎn) 現(xiàn)代生物制藥領(lǐng)域提取純化技術(shù)的進(jìn)步得益于生化分析分離技術(shù)開拓性工作的成果汾離純化技術(shù)的特點(diǎn)之一是各種技術(shù)產(chǎn)互交叉，新型的分離純化方法不斷涌現(xiàn)。如沉淀技術(shù)和親和技夢相結(jié)合?形成了親和沉淀技術(shù);超濾和親和技術(shù)相結(jié)合，形成了嚴(yán)和超濾技術(shù);萃取與載體膜相結(jié)合，形成了液膜載體萃取法。這種新方法取長補(bǔ)短，使分離純化過程更加科學(xué)合理、快速有效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。盡管有些方法仍處于實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)階段，要用于工業(yè)規(guī)模還需要進(jìn)一步探索，有的甚至沒有實(shí)用價值，但都可為今后的產(chǎn)展提供新的思路。 生物藥物提取純化技術(shù)的另一特點(diǎn)是注重新材料的研制開發(fā)如膜分離介質(zhì)，層析介質(zhì)，親和配基，新型萃取劑等在最近幾年來發(fā)展非?？?。提取純化設(shè)備方面推陳出新，在設(shè)備的計算機(jī)控制及生產(chǎn)自動化，連續(xù)化及GMP規(guī)范化等方面取得很大的成就。 膜過濾技術(shù)發(fā)展很快，分為微濾、超濾和納濾，不僅用于細(xì)胞的分離，還用于蛋白質(zhì)的濃縮。超濾技術(shù)的主要特點(diǎn)是節(jié)能，對生物大分子類藥物無破壞作用。液一液萃取廣泛應(yīng)用于抗生素及小分子量藥物的提取。溶劑選擇的余地大，且易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。高速離心式液體萃取機(jī)是目前效率最高，使用最廣的裝置。液一液萃取技術(shù)還衍生出許多新的萃取技術(shù)，如雙水相萃取，親和萃取，超臨界萃取等。雙水相萃取蛋白質(zhì)類藥物是大規(guī)模提取高純度蛋白質(zhì)類藥物的有效技術(shù)。而超臨界界萃取利用超臨界流體的物理特性，即通過壓力和溫度的改變控制溶質(zhì)在溶劑中的分子擴(kuò)散能助，控制溶質(zhì)的溶解度，從而實(shí)現(xiàn)分離。 層析(色譜)技術(shù)是最近幾十年來發(fā)展最快的純化技術(shù)。層析裝置的種類很多，且分離純化機(jī)理也各不相同，適應(yīng)于許多藥物產(chǎn)品的分離純化。離子交換色譜是應(yīng)用最廣，且易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的方法。應(yīng)用于抗生素、氨基酸、核昔酸、蛋白質(zhì)的提取和純化。分子篩層析根據(jù)分子量大小不同的原理，適應(yīng)于蛋白質(zhì)類藥物的純化。層析分離技術(shù)的最高層次當(dāng)屬基于分子識別的技術(shù)如親和層析。這一技術(shù)已衍生出一大批新的技術(shù)，如免疫親和層析、染料親和層析、金屬離子鰲合層析。疏水性層析是基于分子的疏水性能來分離純化的。高效液相色譜法本是分析化學(xué)的常用手段，現(xiàn)已將其擴(kuò)展到生物藥物的分離純化的應(yīng)用中。有些設(shè)備僅可進(jìn)行分析，有的還可用于分離純化，在新藥開發(fā)的過程中，縮短了分離純化所需時間。 與層析技術(shù)同步發(fā)展的各種分離介質(zhì)是層析分離的技術(shù)保障，商品化的預(yù)裝柱、緩沖劑、計算機(jī)程序控制還使操作變得簡單易學(xué)。置換層析與洗脫層析不同，是指吸附在層析柱上的一種組分被另一種置換劑(與層析上的介質(zhì)的親和力大于原被吸附的組分)置換出層析柱的層析技術(shù)。該技術(shù)有上樣量高，分辨率高的特點(diǎn)。被分離的樣品在分離過程中還有濃縮作用。 總之，隨著科技的發(fā)展，新的分離、提取、純化技術(shù)還將不斷得到改進(jìn)。 四、提取純化的工藝論證 我國1992年修訂了GMP,要求從1993年3月1日以后新建或改建的藥廠，均要符合GMP的要求。1994年開始了各項(xiàng)驗(yàn)證，其中工藝論證是關(guān)鍵的一個不可缺少的組成部分.產(chǎn)品的純化是生產(chǎn)過程中關(guān)鍵的一步。這涉及到藥物的質(zhì)量。所謂工藝驗(yàn)證，就是通過系統(tǒng)的方法得到關(guān)于生產(chǎn)工藝的書面材料，證明并保證生產(chǎn)過程能始終如一地生產(chǎn)出特定的高質(zhì)量的產(chǎn)品。提取純化處理工藝驗(yàn)證的范圍包括:廠房設(shè)施、工程儀表、機(jī)械設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境、工藝條件、計算機(jī)軟件、介質(zhì)、原材料、半成品、成品、操作人員素質(zhì)和測試方法等。以上各個部分都要有驗(yàn)證材料或試驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)這些材料和數(shù)據(jù)寫出驗(yàn)證報告。當(dāng)工藝的某一部分有較大變動時(如大修、工藝條件變化)，要進(jìn)行重新驗(yàn)證，即再驗(yàn)證.再驗(yàn)證是針對某一部分的行動，而不是整個工藝過程的驗(yàn)證.因此比較簡單、快速、易行。驗(yàn)證的實(shí)施過程包括以下步驟:提出驗(yàn)證要求，組織驗(yàn)證小組，制定驗(yàn)證方案，實(shí)施驗(yàn)證試驗(yàn)，寫出驗(yàn)證報告，再驗(yàn)證等。 現(xiàn)以生物制藥純化最常用的層析工藝為例，說明驗(yàn)證試驗(yàn)的過程。首先對層析設(shè)備進(jìn)行安裝驗(yàn)證，即在不通電源的情況下，根具設(shè)備說明書查看安裝是否正確，并對接線、管路連接、安放地點(diǎn)、輸人電壓等逐項(xiàng)檢查，無誤后，再進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)試驗(yàn).接通電源后，觀察電機(jī)、泵、監(jiān)測器、信號系統(tǒng)、閥、壓力、溫度等是否正常.泵的輸出流量要經(jīng)過校正，監(jiān)測波長也要校正，運(yùn)轉(zhuǎn)3-5次后，未見漏液、氣泡等，一切正常，方可正式運(yùn)轉(zhuǎn)。層析柱是整個層析工藝的關(guān)鍵設(shè)備，要根據(jù)出廠標(biāo)準(zhǔn)，逐項(xiàng)驗(yàn)證，如載體外觀、顆粒大小(用顯微鏡測量)、柱效率、分辨率、回收率、有無污染等.如更變層析柱或?qū)游鲋盍?，要對新層析柱進(jìn)行重新驗(yàn)證?？傊?，工藝驗(yàn)證是一項(xiàng)技術(shù)性很強(qiáng)，無固定章程可循，既費(fèi)力，又耗時、耗材的工作. 高科技生物藥物的生產(chǎn)工廠，已有“交鑰匙工程”。所謂交鑰匙工程，就是將整個工廠組裝在高強(qiáng)度的，便于運(yùn)輸?shù)匿撝平ㄖY(jié)構(gòu)內(nèi)，整個建筑要達(dá)到潔凈標(biāo)準(zhǔn)，所有的生產(chǎn)設(shè)備和公用設(shè)施都安裝到位。在用戶在場的情況下，要對整個工廠進(jìn)行發(fā)貨前的試運(yùn)轉(zhuǎn)及鑒定。然后，整個工廠的生產(chǎn)設(shè)備和公用設(shè)施直接運(yùn)輸?shù)接脩舻膹S址，在各車間組裝后，與當(dāng)?shù)氐乃㈦?、下水道等系統(tǒng)及倉庫對接，立即就可以投人生產(chǎn)。 五、生物藥物生產(chǎn)的屏蔽防護(hù)技術(shù) (Containment technology) 一些藥物，如抗癌藥，往往對生物活細(xì)胞具有毒性，因此必須對中試或大生產(chǎn)的全過程設(shè)置屏蔽防護(hù)裝置.1984年，F(xiàn)lickinger等就提出了中試和生產(chǎn)規(guī)模細(xì)胞毒素劑的安全生產(chǎn)裝置的設(shè)計概念，其基本要求是:人員進(jìn)出口要加以控制;在工作場所保持負(fù)壓(一級、二級或三級生物密封室):空氣的排放必須通過HEPA過勝器;對有煙霧產(chǎn)生的設(shè)備要有附加的屏蔽防護(hù)裝置;有適當(dāng)?shù)膫€人防護(hù)措施;生產(chǎn)過程中所排放的廢物要有生物學(xué)或化學(xué)的除污方法;對工作人員進(jìn)行醫(yī)療監(jiān)測;環(huán)境監(jiān)測。 六、純化工藝過程的質(zhì)量控制 生物藥物純化工藝技術(shù)要求高，應(yīng)盡可能選用高質(zhì)量的設(shè)備，并要求有清潔的各級GMP廠房。純化方法的設(shè)計應(yīng)考慮到盡可能去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖及其他雜質(zhì);要防止純化過程中帶人有害物質(zhì).如采用柱層析技術(shù)純化，應(yīng)提供填料的質(zhì)量認(rèn)證證明(IS09001證書)，并證實(shí)從柱上不會掉下有害物質(zhì)。樣品上樣前應(yīng)除熱原質(zhì)等。若用親和層析技術(shù)(以單克隆抗體品作為配基)，應(yīng)有檢測可能污染此類外源性物質(zhì)的方法，不應(yīng)含有可測出的異種免疫球蛋白，柱層析配制溶液用水一律用超純水(Milli Q水)。 關(guān)于純度的要求，可視產(chǎn)品的來源、用途和用法而制定，例如經(jīng)反復(fù)多次使用的真核細(xì)胞表達(dá)的制品，要求純度達(dá)到98%以上;多次使用的原核細(xì)胞表達(dá)的制品要達(dá)95%以上;外用制品的純度可降低要求。用于健康人群或用于重癥患者，對純度要求各不相同. 純化工藝的每一步均應(yīng)測定純度，計算提純倍數(shù)收率等。純化工藝過程中應(yīng)盡量避免加人對人體有害的物質(zhì)，若不得不加人，應(yīng)設(shè)法除盡;并在最終產(chǎn)品中檢測殘留量，殘留量應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于危害劑量，還要考慮到多次使用的積蓄作用。 附:基因工程α一型干擾素制備及質(zhì)，控制要點(diǎn) 干擾素是一組多功能的細(xì)胞因子，分為干擾素α、干擾素β、和干擾素γ。干擾素α為多基因產(chǎn)物。分為許多亞型，都是由許多氨基酸殘基組成的多膚。人干擾素γ是一種免疫干擾素，是由100多個氨基酸殘基組成的多肽，天然產(chǎn)品是一種糖蛋白，兩處有糖基化位點(diǎn). 發(fā)酵后可用離心法或其他方法收集菌體，要求盡可能縮小操作的范圍，凡接觸過菌液的用具，如離心杯、轉(zhuǎn)頭和玻璃器皿等應(yīng)浸泡新潔爾滅殺菌1h以上，才可清洗。離心后的廢棄液經(jīng)殺菌后才能倒人下水道。收獲的菌種如在24h內(nèi)破菌裂解，可放在4-80C,否則應(yīng)凍存于_30'C以下的冰箱中，在一300C保存的菌體可使用6個月。將收獲的菌體用適當(dāng)?shù)木彌_液做成所需濃度的均勻懸液，可用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法進(jìn)行裂解，裂解后的菌液，可用高速離心沉淀或其他適當(dāng)方法分離，上清液即為粗制干擾素。不得用對人體有害的化學(xué)試劑裂解菌體，用加酶或其他蛋白裂解菌體時，應(yīng)在半成品內(nèi)證明此種蛋白的含量在允許的范圍內(nèi)，對制品安全及效果沒有影響，并提供檢測方法. 濃縮與純化方法應(yīng)能去除絕大部分非干擾素物質(zhì)。一般要用不同原理多步驟的純化方法，并使干擾素濃縮至一定程度，應(yīng)詳細(xì)說明濃縮純化的全過程。在純化過程中不得加人對人體有害的物質(zhì)，加入的物質(zhì)應(yīng)能在以后的純化過程中被去除或證明其濃度在允許的范圍內(nèi)，不得影響制品的安全與效果。如用異種抗體親和層析純化，應(yīng)說明其來源及純度，并提供此種抗體微量IgG的檢測方法，在半成品檢定中應(yīng)測定IgG的含量，并確定允許濃度。制備注射用制品時濃縮純化過程應(yīng)特別注意去除熱原質(zhì)，并采取措施防止溶液、試劑和容器污染，而造成制品熱原質(zhì)增加。 濃縮純化最后所得的純化干擾素即為“半成品原液”，取樣供作純度檢定后，立即加人人白蛋白，使其最終含量為2%，稱為加“白蛋白半成品”，取樣測定干擾素效價，保存在一300C,應(yīng)盡量避免凍融，直到制劑配制時才取出融化、合并、離心、除菌過濾、制備成品，“加白蛋白半成品”在一300C下保存不得超過半年。 制劑配制:除菌過濾采用0.3μm薄膜，過濾后樣品應(yīng)做無菌試驗(yàn)，并取樣測定干擾素效價，根據(jù)除菌樣品的效價測定結(jié)果，將讓述無菌試驗(yàn)合格的“加白蛋白半成品”用無菌的2 %白蛋白緩沖液稀釋至所需濃度，不得加防腐劑，稀釋后的“加白蛋白半成品”需做熱原測定、效價測定和無菌試驗(yàn)。 冷凍干燥:凍干工藝應(yīng)不損害干擾素的活性，并使凍干后制品的水分達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)。 基因工程干擾素分注射用和外用兩種.其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不同，應(yīng)分別予以規(guī)定。每種制品又分為半成品和成品檢定.