蛋白質(zhì)分離純化的四種方法

【專家解說】：蛋白質(zhì)的分離純化方法 2.1根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白 質(zhì)和小分子物質(zhì)分開,并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機(jī)鹽為主的小分子分開。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用,在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機(jī)鹽。由于超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質(zhì)的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗中,加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后,再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離[3]。使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度(區(qū)帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度?？梢愿鶕?jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動并最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]。 2.2 根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度,根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件,就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。 等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn),而且在等電點(diǎn)時溶解度最 低;相反,有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì)。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn),pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達(dá)到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4,使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來。等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3·8。他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì),得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá)73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白,蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%[12]。 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。應(yīng)當(dāng)指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質(zhì),其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質(zhì)的破壞,應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象,蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。 有機(jī)溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,因此,控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機(jī)溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過高,蛋白質(zhì)變性問題就可以很大程度上得到解決。對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。 萃取是分離和提純有機(jī)化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團(tuán)萃取可以用來分離蛋白質(zhì)。雙水相萃取技術(shù)(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由于被分離物在兩相中分配的不同,便可實(shí)現(xiàn)分離,被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,收率較高。對于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),需要先對細(xì)胞進(jìn)行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮,細(xì)胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響[16]。 反膠團(tuán)萃取法是利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)包裹其中而達(dá)到提取蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)是當(dāng)表面活性劑 在非極性有機(jī)溶劑溶解時自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是萃取過程中蛋 白質(zhì)因位于反膠團(tuán)的內(nèi)部而受到反膠團(tuán)的保護(hù)。程世賢等[17]就利用反膠團(tuán)萃取法提取了大豆中的蛋白質(zhì)。 2.3 根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離純化 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。 在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子)將向著與其電性相反的電極移動,這 種現(xiàn)象稱為電泳。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳,常用于分離蛋白質(zhì)。它的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù),也可以用于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定。利用等電聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在外電場作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點(diǎn)的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低,加樣量不高;等電聚焦電泳分辨率最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。 離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì),被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來,其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì),結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應(yīng)用于濃縮蘋果汁中蛋白質(zhì)的提純。另外,離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取[7]。 2.4 利用對配體的特異親和力進(jìn)行分離純化 親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學(xué)親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來,并且純度相當(dāng)高。應(yīng)用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,以便設(shè)計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結(jié)合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛[21]。范繼業(yè)等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達(dá)到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達(dá)到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機(jī)械強(qiáng)度高、抗污染能力較強(qiáng)、非特異性吸附較小、可反復(fù)使用、適用性廣,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。 3 展望 在實(shí)際工作中,很難用單一方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化,往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質(zhì)。 理想的蛋白質(zhì)分離提純方法,要求產(chǎn)品純度和總回收率越高越好,但實(shí)際上兩者難以兼顧,因此,考慮分離 提純的條件和方法時,不得不在兩者之間作適當(dāng)?shù)倪x擇;一般情況下,科研上更多地選擇前者,工業(yè)生產(chǎn)上 更多地選擇后者。因此,每當(dāng)需要提純某種蛋白質(zhì)時,首先要明確分離純化的目的和蛋白質(zhì)的性質(zhì),以便選擇最佳的分離純化方法,從而得到理想的效果。今后,蛋白質(zhì)提純技術(shù)的發(fā)展將不斷促進(jìn)對蛋白質(zhì)性質(zhì)的研究,同時對蛋白質(zhì)性質(zhì)的研究也將反過來提高蛋白質(zhì)分離純化技術(shù),兩者的互相促進(jìn)終將會對生命科學(xué)的進(jìn)步作出重大貢獻(xiàn)。