色譜法 有什么意義？

【專(zhuān)家解說(shuō)】：由于現(xiàn)代色譜分析技術(shù)具有分離和分析兩種功能，即能排除復(fù)雜組分間的相互干擾，逐個(gè)將組分進(jìn)行定性和定量分析，因此，現(xiàn)代色譜分析技術(shù)非常適合成分復(fù)雜的生藥的有效性評(píng)價(jià)。 色譜法根據(jù)其分離原理可分為：吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質(zhì)在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)。分配色譜是利用被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同使組分分離；其中一相被涂布或鍵合在固體載體上，稱(chēng)為固定相，另一相為液體或氣體，稱(chēng)為流動(dòng)相；常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹(shù)脂上交換能力的不同使組分分離；常用的樹(shù)脂有不同強(qiáng)度的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、陰離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為水或含有機(jī)溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱(chēng)凝膠色譜法，是利用被分離物質(zhì)分子大小的不同導(dǎo)致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據(jù)固定相和供試品的性質(zhì)選用水或有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。 常用色譜法又可根據(jù)分離方法分為：薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。采用薄層色譜法分離有色物質(zhì)時(shí)，可根據(jù)其色帶進(jìn)行區(qū)分；分離無(wú)色物質(zhì)時(shí)，可在短波 (254nm) 或長(zhǎng)波 (365nm) 紫外光燈下檢視，也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質(zhì)的薄層硅膠，采用熒光猝滅法檢視。氣相色譜法和高效液相色譜法可用接于色譜柱出口處的各種檢測(cè)器檢測(cè)。 近年來(lái)隨著各種色譜儀器自動(dòng)化程度的提高，特別是各種聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，使得用現(xiàn)代色譜分析技術(shù)進(jìn)行生藥有效性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制變得越來(lái)越快速、簡(jiǎn)便和靈敏。 （一）薄層色譜法 (thin layer chromatography, TLC) 薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖對(duì)比，并可用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測(cè)定?！吨袊?guó)藥典》 (2005 年版 ) 一部薄層色譜法用于定性鑒別的達(dá) 1 523 項(xiàng)，用于含量測(cè)定的為 45 項(xiàng)，其中有 4 種藥材采用薄層掃描法定量。 1. 操作方法 (1) 薄層板 有市售薄層板（普通或高效板）和自制薄層板，可根據(jù)需要選用。 (2) 點(diǎn)樣 通常在潔凈干燥的環(huán)境，用專(zhuān)用毛細(xì)管或配合相應(yīng)的半自動(dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器械將樣品點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀，點(diǎn)樣基線距底邊 10 ～ 15mm ，高效板一般基線距底邊 8 ～ 10mm 。圓點(diǎn)狀直徑一般不大于 3mm ，高效板一般不大于 2mm ；接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層板表面。條帶狀寬度一般為 5 ～ l0mm 。高效板條帶寬度一般為 4 ～ 8mm ，可用專(zhuān)用半自動(dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器械噴霧法點(diǎn)樣。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜，一般不少于 8mm ，高效板供試品間隔不少于 5mm 。 (3) 展開(kāi) 將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開(kāi)缸中，浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn) 5mm 為宜，密閉。除另有規(guī)定外，一般上行展開(kāi) 8 ～ 15cm ，高效薄層板上行展開(kāi) 5 ～ 8cm 。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測(cè)。 展開(kāi)前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開(kāi)缸中加入適量的展開(kāi)劑，密閉，一般保持 15 ～ 30 分鐘。溶劑蒸氣預(yù)平衡后，應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開(kāi)。如需使展開(kāi)缸達(dá)到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則須在展開(kāi)缸的內(nèi)側(cè)放置與展開(kāi)缸內(nèi)徑同樣大小的濾紙，密閉一定時(shí)間，使達(dá)到飽和再如法展開(kāi)。必要時(shí)，可進(jìn)行二次展開(kāi)或雙向展開(kāi)。 (4) 顯色與檢視 供試品含有可見(jiàn)光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質(zhì)或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質(zhì)可在 365nm 紫外光燈下觀察熒光色譜。對(duì)于可見(jiàn)光下無(wú)色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板 ( 如硅膠 GF 254 板 ) ，在 254nm 紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質(zhì)形成的色譜。 (5) 記錄 薄層色譜圖像一般可采用攝像設(shè)備拍攝，以光學(xué)照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀掃描記錄相應(yīng)的色譜圖。 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用供試品和對(duì)照品對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，使檢測(cè)靈敏度、分離度和重復(fù)性符合要求。 (1) 檢測(cè)靈敏度 用于限量檢查時(shí)，采用供試品溶液和對(duì)照品溶液與稀釋若干倍的對(duì)照品溶液在規(guī)定的色譜條件下，于同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)、檢視，后者應(yīng)顯清晰的斑點(diǎn)。 (2) 分離度 用于鑒別時(shí)，對(duì)照品溶液與供試品溶液中相應(yīng)的主斑點(diǎn)，應(yīng)顯示兩個(gè)清晰分離的斑點(diǎn)。用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度 (R) 的計(jì)算公式為： R ＝ 2(d 2 -d 1 ) ／ (W 1 +W 2 ) 式 (3-5) 式中， d 2 為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離； d 1 為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離； W 1 及 W 2 為相鄰兩峰各自的峰寬。通常分離度應(yīng)大于 1.0 。 (3) 重復(fù)性 同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 3.0 ％；需顯色后測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 5.0 ％。 3. 測(cè)定法 (1) 鑒別 取適宜濃度的對(duì)照品溶液與供試品溶液，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)與檢視，供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色 ( 或熒光 ) 和位置應(yīng)與對(duì)照溶液的斑點(diǎn)一致。 (2) 限度檢查 采用與定量配制的對(duì)照品對(duì)照或?qū)φ掌废♂寣?duì)照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點(diǎn)與相應(yīng)的對(duì)照品溶液或系列對(duì)照品溶液的相應(yīng)斑點(diǎn)比較，顏色 ( 或熒光 ) 不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，峰面積值不得大于對(duì)照品的峰面積值。 (3) 含量測(cè)定 照薄層色譜掃描法，測(cè)定供試品中相應(yīng)成分的含量。 4. 薄層色譜掃描法 系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見(jiàn)光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測(cè)定。測(cè)定時(shí)可根據(jù)不同薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，按照規(guī)定方式掃描測(cè)定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。通常含量測(cè)定應(yīng)使用市售薄層板。 掃描方法可采用單波長(zhǎng)掃描或雙波長(zhǎng)掃描。如采用雙波長(zhǎng)掃描，應(yīng)選用待測(cè)斑點(diǎn)無(wú)吸收或最小吸收的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)，供試品色譜中待測(cè)斑點(diǎn)的比移值 (R f 值 ) 和光譜掃描得到的吸收光譜圖或測(cè)得的光譜最大吸收與最小吸收應(yīng)與對(duì)照品相符，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。薄層掃描定量測(cè)定應(yīng)保證供試品斑點(diǎn)的量在線性范圍內(nèi)，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量，供試品與對(duì)照品同板點(diǎn)樣、展開(kāi)、測(cè)定和計(jì)算。 （二）高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) 高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。 高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用范圍之廣，是其它分析儀器所不能比擬的。隨著儀器的普及和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器的商品化，本法已成為生藥含量測(cè)定的首選和主流方法?！吨袊?guó)藥典》 (2005 年版）一部應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定含量的中藥品種達(dá) 479 種，涉及 518 項(xiàng)，其中藥材就有 98 種 。 1. 對(duì)儀器的一般要求 (1) 色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類(lèi)型的硅烷鍵合硅膠 ( 如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等 ) 也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對(duì)映異構(gòu)體的拆分分析。 填充劑的性能 ( 如載體的形狀、粒徑、孔徑、比表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類(lèi)型等 ) 以及色譜柱的填充，直接影響待測(cè)物的保留行為和分離效果?？讖皆?15nm(1nm=l0?) 以下的填充劑適合于分析分子量小于 2000 的化合物，分子量大于 2 000 的化合物則應(yīng)選擇孔徑在 30nm 以上的填充劑。 以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用 pH2 ～ 8 的流動(dòng)相。當(dāng) pH 大于 8 時(shí)，載體硅膠會(huì)被溶解；當(dāng) pH 小于 2 時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用 pH 大于 8 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機(jī) - 無(wú)機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當(dāng)需使用 pH 小于 2 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機(jī) - 無(wú)機(jī)雜化填充劑等。這些特殊的色譜柱已有商品供應(yīng)。 (2) 檢測(cè)器 最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器 ( ultraviolet detector, UVD) ，其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有二極管陣列檢測(cè)器 ( diode array detector, DAD) 、熒光檢測(cè)器 ( fluorescence detector, FLD) 、示差折光檢測(cè)器 ( refractive index detector, RID) 、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (evaporative light-scattering detector, ELSD) 、電化學(xué)檢測(cè)器 (electrochemical detector, ECD) 和質(zhì)譜檢測(cè)器 (mass spectrometrical detector, MSD) 等。 紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與待測(cè)溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)。二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄待測(cè)物在規(guī)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測(cè)物的光譜測(cè)定和色譜峰的純度檢查。 紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度通常并不呈線性關(guān)系，必要時(shí)需對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。 不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。如采用紫外檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)至少符合紫外 - 可見(jiàn)分光光度法對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動(dòng)相。 (3) 流動(dòng)相 可采用固定比例 ( 等度洗脫 ) 或按規(guī)定程序改變比例 ( 梯度洗脫 ) 的溶劑組成作為流動(dòng)相系統(tǒng)。由于 C- 18 鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于 5 ％，否則 C 18 鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)指標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中更具實(shí)用意義的參數(shù)。 通常用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。 (1) 色譜柱的理論板數(shù) (n) 在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間 t R ( 以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位 ) 和半高峰寬 (W h/2 ) ，按 n=5.54(t R ／ W h/2 ) 2 計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。 (2) 分離度 (R) 無(wú)論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照峰之間有較好的分離度。分離度的計(jì)算公式為： 3) 重復(fù)性 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 2.0 ％。也可配制相當(dāng)于 80 ％、 100 ％和 120 ％的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成 3 種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣 2 次，計(jì)算平均校正因子。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 2.0 ％。 (4) 拖尾因子 (T) 為保證分離效果和測(cè)量精度，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符合相關(guān)規(guī)定。 3. 測(cè)定法 (1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)成分含量 精密稱(chēng) ( 量 ) 取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照品溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子： 校正因子 (f)= 式 (3-8) 式中 As 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； A R 為對(duì)照品的峰面積或峰高； C S 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液的濃度； C R 為對(duì)照品溶液的濃度。 再取含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量： 含量 (C x ) =f × 式 (3-9) 式中 A x 為供試品峰面積或峰高； C x 為供試品溶液的的濃度； A′ s 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； C′ s 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度。 f 為校正因子。 當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照品溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，使用等量同一濃度的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)， C s =C′ s ，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱(chēng) ( 量 ) 取。 (2) 外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)成分含量 精密稱(chēng) ( 量 ) 取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖。 由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中某成分含量時(shí)，以定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。 (3) 面積歸一化法 是測(cè)量色譜圖上某色譜峰和除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算某色譜峰占總面積的百分率。該法通常用于對(duì)照品純度的檢查。 高效液相色譜法樣品進(jìn)樣前的溶液應(yīng)澄清，通常需經(jīng)微孔濾膜 (0.45μm) 濾過(guò)。 （三）氣相色譜法 (gas chromatography, GC) 氣相色譜法系采用氣體為流動(dòng)相 ( 載氣 ) 流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。 氣相色譜法對(duì)含揮發(fā)性成分的生藥應(yīng)用較廣，精密度高，分離效果比薄層色譜好，但所得數(shù)據(jù)只有保留時(shí)間，多數(shù)情況下是在高溫下進(jìn)行，若成分不氣化，就不能進(jìn)行分析，故應(yīng)用范圍受到限制。雖可通過(guò)衍生化法或應(yīng)用特殊色譜柱分析不易揮發(fā)的成分，但遠(yuǎn)不如高效液相色譜方便、準(zhǔn)確。《中國(guó)藥典》 (2005 年版 ) 氣相色譜法用于中藥分析的品種有 47 種，其中有 4 種藥材用此法定量。另外還有兩種藥材的農(nóng)藥殘留也是用 GC 法分析。 1. 對(duì)儀器的一般要求 氣相色譜儀由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測(cè)器的溫度均在控制狀態(tài)。 (1) 載氣源 氣相色譜法的流動(dòng)相為氣體，稱(chēng)為載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發(fā)生器提供，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臏p壓裝置，以一定的流速經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器和色譜柱；根據(jù)供試品的性質(zhì)和檢測(cè)器種類(lèi)選擇載氣，常用載氣為氮?dú)狻? (2) 進(jìn)樣部分 進(jìn)樣方式一般可采用溶液直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣。 溶液直接進(jìn)樣采用微量注射器、微量進(jìn)樣閥或有分流裝置的氣化室進(jìn)樣；采用溶液直接進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫 30 ～ 50℃ ；進(jìn)樣量一般不超過(guò)數(shù)微升；柱徑越細(xì)，進(jìn)樣量應(yīng)越少，采用毛細(xì)管柱時(shí)，一般應(yīng)分流以免過(guò)載。 頂空進(jìn)樣適用于固體和液體供試品中揮發(fā)性組分的分離和測(cè)定。將固態(tài)或液態(tài)的供試品制成供試液后置于密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在非氣態(tài)和氣態(tài)達(dá)至平衡后，由進(jìn)樣器自動(dòng)吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。 (3) 色譜柱 色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱。填充柱的材質(zhì)為不銹鋼或玻璃，內(nèi)徑為 2~4mm ，柱長(zhǎng)為 2~4m ，內(nèi)裝吸附劑、高分子多孔小球或涂漬固定液的載體，粒徑為 0.25~0.18mm 、 0.18~0.15mm 或 0.15~0.125mm 。常用載體為經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細(xì)管柱的材質(zhì)為玻璃或石英，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)固定液，內(nèi)徑一般為 0.25mm 、 0.32mm 或 0.53mm ，柱長(zhǎng) 5~60m ，固定液膜厚 0.1~5.0μm ，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。 新填充柱和毛細(xì)管柱在使用前需老化以除去殘留溶劑及低分子量的聚合物，色譜柱如長(zhǎng)期未用，使用前應(yīng)老化處理，使基線穩(wěn)定。 (4) 柱溫箱 由于柱溫箱溫度的波動(dòng)會(huì)影響色譜分析結(jié)果的重現(xiàn)性，因此柱溫箱控溫精度應(yīng)在 ±l℃ ，且溫度波動(dòng)小于每小時(shí) 0.1℃ 。溫度控制系統(tǒng)分為恒溫和程序升溫兩種。 (5) 檢測(cè)器 適合氣相色譜法的檢測(cè)器有火焰離子化檢測(cè)器 ( flame ionization detector , FID) 、熱導(dǎo)檢測(cè)器 ( thermal conductivity detector, TCD ) 、氮磷檢測(cè)器 (nitrogen-phosphorus detector, NPD) 、火焰光度檢測(cè)器 ( flame photometric detector , FPD) 、電子捕獲檢測(cè)器 ( electron capture detector , ECD) 、質(zhì)譜檢測(cè)器 (mass spectrometric detector, MSD) 等?；鹧骐x子化檢測(cè)器對(duì)碳?xì)浠衔镯憫?yīng)良好，適合檢測(cè)大多數(shù)的化合物；氮磷檢測(cè)器對(duì)含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測(cè)器對(duì)含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測(cè)器適于含鹵素的化合物；質(zhì)譜檢測(cè)器能給出供試品某個(gè)成分相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息，可用于結(jié)構(gòu)確證。常用檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，用氫氣作為燃?xì)?，空氣作為助燃?xì)猓谑褂没鹧骐x子化檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器溫度一般應(yīng)高于柱溫，并不得低于 150℃ ，以免水汽凝結(jié)，通常為 250 ～ 350℃ 。 (6) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 可分為記錄儀、積分儀以及色譜工作站等。 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 同高效液相色譜法。 3. 測(cè)定法 (1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某成分含量。 (2) 外標(biāo)法測(cè)定供試品中某成分含量。 (3) 面積歸一化法。 上述 (1)~(3) 法的具體內(nèi)容均同于高效液相色譜的相應(yīng)方法。 (4) 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法測(cè)定供試品中某成分含量 精密稱(chēng) ( 量 ) 取某待測(cè)成分對(duì)照品適量，配制成適當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定待測(cè)成分含量，再扣除加入的對(duì)照品溶液含量，即得供試液溶液中某待測(cè)成分含量。 氣相色譜法定量分析，當(dāng)采用手工進(jìn)樣時(shí)，由于留針時(shí)間和室溫等對(duì)進(jìn)樣量的影響，使進(jìn)樣量不易精確控制，故最好采用內(nèi)標(biāo)法定量；而采用自動(dòng)進(jìn)樣器時(shí)，由于進(jìn)樣重復(fù)性的提高，在保證進(jìn)樣誤差的前提下，也可采用外標(biāo)法定量。當(dāng)采用頂空進(jìn)樣技術(shù)時(shí)，由于供試品和對(duì)照品處于不完全相同的基質(zhì)中，故可采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)果為準(zhǔn)。 （四）其它色譜分析方法 1. 高效毛細(xì)管電泳 (high performance capillary electrophoresis, HPCE) 高效毛細(xì)管電泳是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，在毛細(xì)管中按其淌度或分配系數(shù)的不同進(jìn)行高效、快速分離的新型 “ 液相色譜 ” 技術(shù)，它是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為了可能，成為生物化學(xué)和分析化學(xué)中最受矚目的、發(fā)展最快的一種分離分析技術(shù)，它在復(fù)雜樣品的分離分析中將扮演越來(lái)越重要的角色。 2. 毛細(xì)管電色譜 (capillary electrochromatography ， CEC ） 毛細(xì)管電色譜是綜合了毛細(xì)管電泳 (capillary electrophoresis ， CE) 和高效液相色譜 (HPLC) 的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展起來(lái)的新型高效電分離微柱液相色譜技術(shù)。 CEC 一般采用熔融的石英毛細(xì)管柱，在柱內(nèi)填充或管壁鍵合固定相，用高壓直流電源 ( 或外加一定的壓力）代替高壓泵，產(chǎn)生電滲流 (electroosmotic flow ， EOF) 代替壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，溶質(zhì)依據(jù)它們?cè)诹鲃?dòng)相與固定相中的分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，因而既能分離中性物質(zhì)又能分離帶電組分。 近年來(lái)高效毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜在生藥化學(xué)成分的分析中有許多嘗試，取得顯著進(jìn)展。