以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項(xiàng)

【專家解說】：1.樣品處理：對被分離樣品有時(shí)要經(jīng)過水解等化學(xué)處理，樣品溶液一般要兼顧到濃度與粘度兩方面。 + B4 ^: J  i3 _) \- T: R/ |" v2.離子交換柱的安裝：層析柱內(nèi)徑必須粗細(xì)均勻，柱管大小可據(jù)實(shí)際需要選擇。柱下端膠塞中插入一放液管，膠塞上蓋以園形尼龍綢或發(fā)泡塑料片以防止交換樹脂流出。 + H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.裝柱：⑴裝柱質(zhì)量是確保柱層析分離效果的技術(shù)關(guān)鍵之一，越是高技術(shù)層析(如使用毛細(xì)管層析柱的高級層析設(shè)備)裝柱的技術(shù)要求和難度越高，以至手工操作很難達(dá)到。⑵裝柱的質(zhì)量要求，無論是手工、機(jī)械、自動(dòng)化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結(jié)節(jié)，能保持正常的溶脹形態(tài)和結(jié)構(gòu)；⑶裝入柱中樹脂的高度與直徑之比因分離對象和分離目的不同而相差很大，本教材推薦的肝素鈉洗脫柱裝柱高度是柱徑的4～6倍。⑷操作次序，以手工裝入溶脹的D254樹脂（濕法裝柱）為例，其操作程序可概括為：①查連接(柱與塞之間、上下塞與進(jìn)出液管之間、梯度混合器與進(jìn)液管之間、出液管與收集器之間等等的連接是否正確、緊密)，②試止漏（塞子、接頭、活塞開關(guān)處在長時(shí)間滿負(fù)荷下不泄漏），③加隔離緩沖墊（緊貼于柱子下端塞子的內(nèi)平面），④加少許平衡液于空柱內(nèi)，⑤趕氣泡（緩沖墊內(nèi)和出水管中的氣泡），⑥開通放水開關(guān)，⑦與放水量保持相當(dāng)?shù)牧魉?，向柱?nèi)勻速加完載體材料漿，⑧關(guān)閉放水開關(guān)，令樹脂自然下沉，⑨用洗滌液和清水洗滌樹脂，⑩最后用緩沖液過柱和平衡柱，使樹脂結(jié)構(gòu)平衡穩(wěn)定，⑾在樹脂表面蓋上一片尼龍或泡膜塑料，并與柱子內(nèi)壁保持嚴(yán)密接觸，以防加樣時(shí)樹脂泛起。 ( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v  b* m4.加樣：緩緩打開柱子下端的放液開關(guān),使柱內(nèi)液面剛好降至樹脂面時(shí)便立即將樣品溶液小心地加到尼龍或泡膜塑料片上，待樣品液面剛好進(jìn)入樹脂層內(nèi)便立即加入少許平衡緩沖液,以清洗粘附在覆蓋層中的樣品，并隨之進(jìn)入樹脂層。當(dāng)柱內(nèi)液位接近樹脂表面時(shí)便立即添加洗滌液進(jìn)行洗滌操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q 5.洗滌：選用合適的洗滌液、恰當(dāng)?shù)目傆昧考跋礈炝魉?，小心洗滌柱?nèi)樹脂，以除去不被離交樹脂吸附的雜質(zhì)。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _ 6.洗脫：由洗脫曲線找出洗脫液的最佳濃度和適當(dāng)?shù)目偭?、操作壓及流速進(jìn)行洗脫。 5 m- U  F# X! m' M. O# g! |7.監(jiān)測：用敏感快速的方法（參見下文“測定”）監(jiān)測分離成分是否洗脫出來以及洗脫峰的軸向分布 9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦發(fā)現(xiàn)待分離成分洗脫出來便可進(jìn)行一步或分步收集，并可根據(jù)各成分洗脫峰的軸向分布和濃度監(jiān)測，決定產(chǎn)品收集濃度區(qū)段，棄去的洗脫液可循環(huán)用于相同成分的洗脫。 1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ]  M; J8 m9.沉淀/離心：用沉淀劑可將分離組分沉淀或離心下來脫水干燥，沉淀劑回收再用。 " a3 @7 z0 a' t10.脫水干燥：加入適當(dāng)脫水劑為如無水乙醇、丙酮或乙醚脫水后進(jìn)一步干燥。5 _" H" J" X0 e% v" V 11.測定：對層析所得產(chǎn)品可稱重或測定活性計(jì)算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 ` 【注意事項(xiàng)】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f 1.應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的理化性質(zhì)、分子大小、分子形狀和分離的目的要求，選擇分離效果好、交換容量大而機(jī)械強(qiáng)度較高的分離載體材料。市售的分離載體有明確的規(guī)格型號、理化性質(zhì)、功能作用、活化再生和保養(yǎng)存放等技術(shù)參數(shù)資料可供用戶選擇。 * K7 Q, U. T% x8 y5 R2.應(yīng)根據(jù)分離純化的對象、規(guī)模選擇層析柱的長短、粗細(xì)、柱高與內(nèi)徑之比，使達(dá)到最佳分離效果；此外，柱子材料的化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定、透明，內(nèi)徑要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利于緊固、連接、裝柱與維護(hù)。 4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、穩(wěn)固，與之相連的各種線路、管道、設(shè)備、設(shè)施的布局和連接要緊奏，要方便操作、觀察與維護(hù)。4 F5 w( v8 w+ c4 C 4.要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結(jié)節(jié)，能保持正常的溶脹形態(tài)和結(jié)構(gòu)。5 F  n1 O% }8 d  z+ T0 L# t2 |3 C 5.保持柱內(nèi)樹脂層面平整、層序結(jié)構(gòu)始終如一是確保柱層析分離效果的又一技術(shù)關(guān)鍵。為此，從裝柱到洗脫結(jié)束的過程中，尤其是加樣、洗滌、洗脫過程中要始終保持柱內(nèi)液位不低于柱內(nèi)樹脂的頂部平面，尤其要始終保持柱內(nèi)樹脂的層序結(jié)構(gòu)始終如一，不被打亂，特別要防止更換濃度不同的洗滌洗脫液時(shí)發(fā)生“翻缸”而攪亂樹脂層結(jié)構(gòu)，“壓缸”而造成柱層斷裂和梗塞斷流。 7 z/ W" C+ E8 q: i& t  g6.注意保持一定的操作壓，這對確保層析柱流速和分離效果十分重要。因?yàn)榱魉俨粌H與洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關(guān)，也與裝柱材料的粒度、交聯(lián)度、機(jī)械強(qiáng)度有關(guān)。應(yīng)針對具體情況建立一個(gè)操作壓、流速和分離效果的最佳平衡點(diǎn)。 ; N( j  K7 n0 T" {9 [$ S6.顯著標(biāo)明各種洗滌、洗脫液的技術(shù)參數(shù)，嚴(yán)禁亂用和混用。) M) k" o* {2 g( F 7.制作洗脫曲線，確定洗脫液收集方案，設(shè)置洗脫監(jiān)控點(diǎn)。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V 8.注意剔除破損樹脂，及時(shí)補(bǔ)足流失、破損的循環(huán)樹脂量。 # S5 F  F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.嚴(yán)格掌握新、舊樹脂的活化、再生條件，及時(shí)再生舊樹脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g 樹脂的再生：每次洗脫結(jié)束，用清水將樹脂洗出柱體再用、再生，或用高濃度的NaCl溶液浸泡貯存。樹脂經(jīng)過一段使用后樹脂上的活性基團(tuán)因被交換而使交換容量大為降低，此時(shí)樹脂需要再生處理。( z# |! T+ @) z" O 大處理（酸—堿—酸）：加入樹脂2倍量的2mol HCL溶液攪拌3小時(shí)，自來水沖洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸處理方式處理；再用2mol HCL處理。 5 F% O1 U$ W2 r小處理（堿—酸）：濃度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i 連續(xù)用數(shù)次的樹脂進(jìn)行小處理，用十次后的樹脂要進(jìn)行大處理。 4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脫水干燥條件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x