提取植物葉片中的水楊酸及測(cè)定其含量的方法

【專家解說(shuō)】：答： 一般采用柳樹(shù)，楊樹(shù)，冬青樹(shù)皮或獼猴桃果實(shí)等來(lái)提，當(dāng)然楊柳科的樹(shù)葉中水楊酸含量也是很高的。 水楊酸(salicylic acid，SA)是一種植物界廣泛存在的天然物質(zhì)，它不僅具有重要的藥理效應(yīng)，而且對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及植物抗病性方面有著廣泛的調(diào)控作用 。SA處理可以延緩多種果實(shí)的成熟衰老進(jìn)程。通過(guò)測(cè)定果實(shí)成熟衰老過(guò)程中組織內(nèi)源SA水平的變化，可以更好了解果實(shí)成熟衰老機(jī)理，為SA及其衍生物調(diào)控果實(shí)成熟衰老進(jìn)程積累基礎(chǔ)。但是植物組織中內(nèi)源SA水平很低，一般在1．0～8．4p~g／g之間_4-一-，果實(shí)組織中含量則相對(duì)更低，因此如何更有效地提取組織中的SA，并配以更靈敏的檢測(cè)方法，是研究SA對(duì)果實(shí)成熟衰老調(diào)控的重要內(nèi)容。 現(xiàn)有的植物組織內(nèi)源SA提取方法比較復(fù)雜，要經(jīng)過(guò)提取、液液分配、蒸干等多個(gè)步驟，回收率較低，一般在34．0％～80．7％之間，而血液中SA的提取是通過(guò)乙醚或乙醚與石油醚混合物一步萃取法，較現(xiàn)有的植物組織中SA提取法更為簡(jiǎn)便。 1，提取方法： 取l0．0g葉片充分研磨后，置于50mL的離心管中， 加4．0mL 5％ 的三氯乙酸， 加水至20．0mL后再加入30．0mL乙醚，充分搖勻，浸提12h， 于l 000~g下離心5.0min，取出上部乙醚相，水相再經(jīng)乙醚重復(fù)提取2次，合并乙醚相，真空旋轉(zhuǎn)蒸干后，加入1．0mL 50％甲醇50％乙酸緩沖液(pH3．2)的混合液將其溶解，置于Ep— pendorf管中保存，即為游離態(tài)SA樣品。水相加l8．5％的HCI至終濃度為3．2％，于80cI=水浴中加熱1．0h，冷卻后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1．0mL 50％ 甲醇+50％乙酸緩沖液(pH3．2)的混合液溶解，置于Eppendorf管中保存，即為結(jié)合態(tài)SA樣品。樣品經(jīng)0，3 Ixm 的微孑L過(guò)濾器過(guò)濾后，用高效液相色譜(HPLC)進(jìn) 行檢測(cè)。 2，測(cè)定含量 1-2 主要儀器與試劑 主要儀器：Beckman高效液相色譜儀(帶化學(xué)工作站)，島津熒光檢測(cè)器，Heidolp旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó))。 SA標(biāo)準(zhǔn)品，上海五聯(lián)化工廠生產(chǎn)；甲醇為色譜純，天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)；其余所用試劑均為分析純；水(二次蒸餾水，自制)。 HPLC檢測(cè)條件 Cl8柱，7．3mm~20cm；流動(dòng)相： 甲醇：乙酸緩沖液(pH3．2)=50：50；島津熒光檢測(cè)器(激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為415nm)；流速為1．0mIMmin；進(jìn)樣量為201xL。 1．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用50％甲醇+50％乙酸緩沖液(pH3．2)的混合液配制濃度為l，0m g／mL的SA溶液，再稀釋成0、0．25、0．5、l，0、2，01xg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用HPLC測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。 具體參考文獻(xiàn)： 題目：《獼猴桃果實(shí)中內(nèi)源水楊酸的提取、測(cè)定及其在采后研究中的應(yīng)用》獼猴桃果實(shí)中內(nèi)源水楊酸的提取、測(cè)定及其在采后研究中的應(yīng)用=Extraction and Determination of Endogenous Salicylic Acid from Kiwifruit and Its Application to Postharvest Research[刊，中]/張玉（浙江大學(xué)果實(shí)分子生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310029），陳昆松，張上隆//中國(guó)食品學(xué)報(bào).—2004，4（3）.—6～9 摘要：建立一種更有效的水楊酸（SA）提取、測(cè)定方法是了解SA對(duì)采后果實(shí)成熟衰老生理影響和調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)。本文采用乙醚一步萃取法提取獼猴桃果實(shí)組織中內(nèi)源SA，用高效液相色譜法（熒光檢測(cè)器）測(cè)定其含量。結(jié)果顯示，本方法回收率為（96.4±3.0）%，顯著高于其它已報(bào)道的方法，最低檢測(cè)限為0.9ng／g·FW。SA的熒光峰面積與濃度在0～2.0μg／mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，達(dá)到極顯著水平（r＝0.9991**），該方法簡(jiǎn)便易行，樣品提取時(shí)間比以往報(bào)道的方法節(jié)省一半，因此可用于成熟果實(shí)組織中的內(nèi)源SA萃取和測(cè)定。圖4表1參12。 可以到VIP網(wǎng)上詳細(xì)查詢