有誰做過膳食纖維的測定，能不能告訴我實(shí)驗(yàn)室可行的具體測定步驟和注意事項(xiàng)？

【專家解說】：酶-重量法 1.原理： 樣品分別用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶進(jìn)行酶解消化以去除蛋白質(zhì)和可消化的淀粉。總膳食纖維（TDF）是先酶解，然后用乙醇沉淀，再將沉淀物過濾，將TDF殘?jiān)靡掖己捅獩_洗，干燥稱重。不溶性和可溶性膳食纖維（IDF和SDF）是酶解后將IDF過濾，過濾后的殘?jiān)脽崴疀_洗，經(jīng)干燥后稱重。SDF是將上述濾出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再過濾，干燥，稱重。 TDF、IDF和SDF量通過蛋白質(zhì)、灰分含量進(jìn)行校正。 2.適用范圍 AOAC991.43 本方法適用于各類植物性食物和保健食品。 3.儀器 3.1燒杯：400或600ml高腳型。 3.2 過濾用坩堝：玻料濾板，美國試驗(yàn)和材料學(xué)會(huì)（ASTM）40-60μm，Pyrex 60ml（Corning No.36060 buchner，或同等的）。如下處理： （1） 在灰化爐525℃灰化過夜。爐溫降至130℃以下取出坩堝。 （2） 用真空裝置移出硅藻土和灰質(zhì)。 （3） 室溫下用2%清洗溶液浸泡1小時(shí)。 （4） 用水和去離子水沖洗坩堝；然后用15ml丙酮沖洗然后風(fēng)干。 （5） 在干燥的坩堝中加0.5g硅藻土，在130℃烘干恒重。 （6） 在干燥器中冷卻1小時(shí)，記錄坩堝加硅藻土重量，精確至0.1mg。 3.3 真空裝置： （1） 真空泵或抽氣機(jī)作為控制裝置。 （2） 1L的厚壁抽濾瓶。 （3） 與抽濾瓶相配套的橡皮圈。 3.4振蕩水浴箱： （1） 自動(dòng)控溫使溫度能保持在98±2℃。 （2） 恒溫控制在60℃。 3.5 天平：分析級(jí)，精確至±0.1mg。 3.6馬福爐：溫度控制在525±5℃。 3.7干燥箱：溫度控制在105和130±3℃。 3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥劑。干燥劑兩周一次在130℃烘干過夜。 3.9 PH計(jì)：注意溫控，用pH4.0、7.0和10.0緩沖液標(biāo)化。 3.10 移液管及套頭：容量100μl和5ml。 3.11 分配器或量筒： （1） 15±0.5ml，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。 （2） 40±0.5ml，供分配緩沖液。 3.12. 磁力攪拌器和攪拌棒。 4. 試劑 全過程使用去離子水，試劑不加說明均為分析純?cè)噭? 4.1 乙醇溶液： （1） 85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。 （2） 78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。 4.2 丙酮： 4.3 供分析用酶：在0-5℃下儲(chǔ)存。 （1） 熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液：Cat. No. A3306，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO63178，或 Termamyl 300L，Cat. No. 361-6282，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。 （2） 蛋白酶：Cat. No. P3910，Sigma Chemical Co.，或等效的。當(dāng)天用MES/TRIS緩沖液中現(xiàn)配50mg/ml酶溶液。 （3） 淀粉葡糖苷酶溶液：Cat. No. AMG A9913，Sigma Chemical Co.，或等效的。 4.4 硅藻土：酸洗（Celite 545 AW，No.C8656，Sigma Chemical Co.，或等效的）。 4.5 洗滌液：兩者挑一。 （1） 鉻酸：120g重鉻酸鈉Na2Cr2O7·2H2O，1000ml蒸餾水和1600ml濃硫酸。 （2） 實(shí)驗(yàn)室用液體清潔劑，預(yù)備急需清洗的（Micro，International Products Corp.，Trenton，NJ08016，或等效的）。用水配制2%溶液。 4.6 MES-TRIS緩沖液：0.05mol/L，溫度在24℃時(shí)pH值為8.2。 （1） MES：2-（N-嗎啉代）磺酸基乙烷（No.M-8250，Sigma Chemical Co.或等效的）。 （2） TRIS：三羥（羥甲基）氨基甲烷（No.T-1503，Sigma Chemical Co.或等效的）。 在1.7L的蒸餾水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS，用6mol/L NaOH調(diào)pH到8.2，用水定容至2L。（注意：24℃時(shí)的pH為8.2，但是，如果緩沖液溫度在20℃，pH就為8.3，如果溫度在28℃，pH為8.1。為了使溫度在20-28℃之間，需根據(jù)溫度調(diào)整pH值。） 4.7 鹽酸溶液：0.561mol//L，加93.5ml6mol/L鹽酸到700ml水中，用水定容至1L。 5. 操作方法 5.1. 樣品制備： （1） 固體樣品：如果樣品粒度＞0.5mm，研磨后過0.3-0.5mm（40-60目）篩。 （2） 高脂肪樣品：如果脂肪含量＞10%，用石油醚去脂。每克樣品用25ml，每次提取完靜置一會(huì)兒再小心將燒杯傾斜，慢慢將石油醚倒出，共洗三次。 （3） 高碳水化合物樣品：如果樣品干重含糖＞50%，用85%乙醇去除糖份，每克樣品每次10ml，共洗三次輕輕倒出，然后在40℃烘箱中不時(shí)翻攪干燥過夜，并研磨過0.5mm篩。 5.2. 樣品消化 （1） 準(zhǔn)確稱取雙份1.000±0.005g樣品（M1和M2），置于高腳燒杯中。 （2） 在每個(gè)燒杯中加入40ml MES-TRIS緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌直到樣品完全分散。（防止團(tuán)塊形成，使受試物與酶能充分接觸）。 （3） 用熱穩(wěn)定的淀粉酶進(jìn)行酶解處理：加100μl熱穩(wěn)定的淀粉酶溶液，低速攪拌。用鋁箔片將燒杯蓋住，在95-100℃水浴中反應(yīng)30分鐘。（ 起始的水浴溫度應(yīng)達(dá)到95℃）。 （4） 冷卻：所有燒杯從水浴中移出，涼至60℃。打開鋁箔蓋，用刮勺將燒杯邊緣的網(wǎng)狀物以及燒杯底部的膠狀物刮離，以使樣品能夠完全的酶解。用10ml蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。 （5） 用蛋白酶進(jìn)行酶解處理：在每個(gè)燒杯中各加入100μl蛋白酶溶液。用鋁箔蓋住，在60℃持續(xù)搖動(dòng)反應(yīng)30分鐘（開始時(shí)的水浴溫度應(yīng)達(dá)60℃），使之充分反應(yīng)。 （6） pH值測定：30分鐘后，打開鋁箔蓋，攪拌中加入5ml0.561mol/L HCL至燒杯中。60℃時(shí)用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCL溶液調(diào)最終pH為4.0-4.7。（注意：當(dāng)溶液為60℃時(shí)檢測和調(diào)整pH，因?yàn)樵谳^低溫度時(shí)pH會(huì)偏高。） （7） 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解處理：攪拌同時(shí)加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。用鋁箔蓋住，在60℃持續(xù)振搖反應(yīng)30分鐘，溫度應(yīng)恒定在60℃。 5.3 測定 5.3.1.總的膳食纖維測定 （1） 用乙醇沉淀膳食纖維：在每份樣品中，加入預(yù)熱至60℃的95%乙醇225ml，乙醇與樣品的體積比為4∶1。 室溫下沉淀1小時(shí)。 （2） 過濾裝置：用15ml78%乙醇將硅藻土濕潤和重新分布在已稱重的坩堝中。用適度的抽力把坩堝中的硅藻土吸到玻板上。 （3） 酶解過濾，用78%乙醇和刮勺轉(zhuǎn)移所有內(nèi)容物微粒到坩堝中。（注意：如果一些樣品形成膠質(zhì)，用刮勺破壞表面，以加速過濾。） （4） 抽真空，分別用15ml的78%乙醇，95%乙醇和丙酮沖洗殘?jiān)?次，將坩堝內(nèi)的殘?jiān)楦珊笤?05℃烘干過夜。將坩堝置干燥器中冷卻至室溫。坩堝重量，包括膳食纖維殘?jiān)凸柙逋?，精確稱至0.1mg。減去坩堝和硅藻土的干重，計(jì)算殘?jiān)亍? （5） 蛋白質(zhì)和灰分的測定:取成對(duì)的樣品中的一份測定蛋白質(zhì)，用 本書前述或GB-960.52方法測定。用（N×6.25作為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換系數(shù)）。 分析灰分時(shí)用平行樣的第二份在525℃灼燒5小時(shí)，在干燥器中冷卻，精確稱至0.1mg，減去坩堝和硅藻土的重量，即為灰分重量。 5.3.2 .不溶性膳食纖維測定： （1） 稱適量樣品按5.2進(jìn)行酶解，過濾前用3ml水濕潤和重新分布硅藻土在預(yù)先處理好的坩堝上，保持抽氣使坩堝中的硅藻土抽成均勻的一層。 （2） 過濾并沖洗燒杯，用10ml70℃水洗殘?jiān)?次，然后再過濾并用水洗，轉(zhuǎn)移到600ml高腳燒杯，保留用以測定可溶性膳食纖維，按5.3.3。 （3） 用抽濾裝置，分別用15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各沖洗殘?jiān)?次。 （注意：應(yīng)及時(shí)用78%乙醇、95%乙醇和丙酮沖洗殘?jiān)駝t可造成不溶性膳食纖維數(shù)值的增大。） （4）按5.3.1.5用雙份樣品測定蛋白質(zhì)和灰分。 5.3.3.可溶性膳食纖維測定： （1） 將不溶性膳食纖維過濾后的濾液收集到600ml高腳燒杯中，對(duì)比燒杯和濾過液，估計(jì)容積。 （2） 加約濾出液4倍量已預(yù)熱至60℃的95%乙醇。或者將濾液和洗過殘?jiān)恼麴s水的混合液調(diào)至80g，再加入預(yù)熱至60℃的95%乙醇320ml。 （3） 室溫下沉淀1小時(shí)。下面按5.3.1測定總膳食纖維，從"濕潤和重新分布硅藻土……"。 6. 計(jì)算 TDF、IDF、SDF均用同一公式計(jì)算 膳食纖維（DF，g/100g）測定： DF={[（R1+R2）/2]-P-A}/[（M1+M2）/2]×100 式中：R1和R2=雙份樣品殘留物重量（mg） P和A=分別為蛋白質(zhì)和灰分重量（mg） M1和M2=樣品重量（mg）