如果molish反應呈陽性,怎么證明中藥的醇提液或水提液中有苷類成分？

【專家解說】：　　摘 要 利用系統(tǒng)溶劑分離法和陽離子樹脂吸附交換，對板藍根的化學成分進行了分離，再利用雞胚羊膜腔半體內法進行抗流感病毒活性實驗，最后證明活性部位為親水性的、被陽離子吸附部分。 　　關鍵詞 板藍根 抗流感病毒 有效部位 　　靛青系十字花科植物Isatis indigotica Fort.，其根作為板藍根入藥，具有清熱解毒，涼血之功效。臨床上廣泛用于治療肝炎、腮腺炎、流感、丹毒、流腦和扁桃體炎等病毒、細菌性疾病。藥理研究證實：板藍根的水提液對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、八聯(lián)珠菌、大腸桿菌等8種細菌均有強烈的抑制作用。長期以來，人們一直認為靛苷是板藍根抗病毒、抗菌的有效成分，并把它的含量作為控制板藍根制劑質量的指標〔1～3〕，但實驗表明，靛苷在動物的胃、小腸和盲腸中均被分解破壞，而且自體內排出很快，體外也無明顯的抗菌、抗病毒活性。為了搞清板藍根抗流感病毒的有效成分，同時也為了給板藍根制劑的質量控制提供真實可靠的指標，我們在預實驗即板藍根的水提液和乙醇提取液對抗流感病毒活性實驗取得肯定結果的基礎上，做了進一步的有效部位的篩選工作，除確定其有效部位為陽離子樹脂吸附部分外，還證實有效部位經酸水解后，立即喪失活性，即有效部位為結合氨基酸。 　　1 材料 　　板藍根：市售，為十字花科植物Isatis indigotica Fort.的根；雞胚：濟南養(yǎng)雞場購進時為4日齡，室內再孵化5d；陽離子交換樹脂：市售，732型，鄭州市化學試劑三廠；鹽酸嗎啉雙呱：市售。實驗用的流感病毒毒株：甲型流感病毒株，在樣品Ⅰ～Ⅵ中用國家代表株A/津防/78/77；在樣品Ⅶ，Ⅷ中用國家代表株A/粵防/44/89。乙型流感病毒毒株，在樣品Ⅰ，Ⅱ中用國家代表株乙/青島/37/90；在樣品Ⅲ～Ⅵ中用國家代表株乙/粵防/3/91；在樣品Ⅶ，Ⅷ中用國家代表株乙/滬防/3/91。 　　2 實驗方法 　　2.1 取靛青根粗粉5 kg,用70%工業(yè)乙醇滲漉至提取液顏色極淺，旋轉薄膜蒸發(fā)回收溶劑至醇味很淡，得乙醇提取物3 700mL。取上述提取液370mL(相當于原藥材500g)，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部分和水層部分。前三部分分別回收溶劑至小體積，加吐溫-80 5g，然后用蒸餾水配成500mL溶液。水層經過適當濃縮至每毫升相當于原藥材1g。編號為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ。 　　2.2 其余的乙醇提取物依照方法2.1制成4個部分：前三部分回收溶劑至無有機溶劑氣味，水層適當濃縮至無明顯正丁醇氣味。 　　2.3 將水層配成每毫升相當于0.5g原藥材的水溶液，3～5mL/min的流速通過經預處理過的強酸型陽離子交換樹脂。流出液分段收集，得到A，B兩部分。A部分對茚三酮反應呈陰性，B部分對茚三酮反應呈陽性。從A部分取出少量，用氨水調至近中性，編號為Ⅴ。 　　2.4 將陽離子交換樹脂柱先用蒸餾水沖洗至中性，再用2mol/L氨水洗脫。分段收集，每份約100 mL，用硅膠TLC進行檢查，合并斑點相同部分。第16～26流分減壓濃縮，置冰箱內，析出氨基酸的粗結晶。將粗品用30%乙醇重結晶，得精氨酸純品，配成0.01g/mL水溶液，用乙酸中和至pH5～6，編號為Ⅵ。 　　2.5 經樹脂交換后的B部分，硅膠TLC顯示含脯氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸、酪氨酸。用氨水中和至pH5～6，編號為Ⅶ。 　　2.6 被樹脂吸附后用2mol/L氨水洗脫下來的氨基酸粗結晶(第4～12流分)，經硅膠TLC檢查主要含精氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸。取此結晶配成0.02g/mL水溶液，乙酸中和至pH 5～6，編號為Ⅷ。它們抗流感病毒的活性情況見表1。 　　將活性最強的Ⅲ和Ⅳ用15%的硫酸加熱至90℃ 1h后，即喪失活性。同時發(fā)現(xiàn)水解后的門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和蛋氨酸的量均為水解前的3倍，因此，抗流感病毒的活性可初步確定為結合氨基酸。 　　表1 不同編號樣品抗流感病毒活性結果 　　樣品 　　編號 不同濃度試樣抗甲型流感病毒活性 不同濃度試樣抗乙型流感病毒活性 　　1∶1 1∶5 1∶10 1∶20 1∶40 1∶80 1∶1 1∶5 1∶10 1∶20 1∶40 1∶80 　　Ⅰ +--- ---- ---- ---- ---- +--- +--- ---- ---- ---- ---- 　?、?+--- ---- ---- ---- ---- +--- +--- ---- ---- ---- ---- 　?、?++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++-- 　　Ⅳ ++++ ++++ ++++ ++++ ++-- ++++ ++++ ++++ ++++ ++-- 　?、?---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 　　Ⅵ ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 　?、?+++- +++- +++- +++- +++- +++- +++- +++- 　?、?++++ ++++ ++-- +++- +++- +++- +++- 　　注：++++完全抑制病毒生長 +++-抑制大部分病毒生長 ++--抑制部分病毒生長 +---基本上不能抑制病毒生長 ----不能抑制病毒生長 　　3 小結 　　本實驗證實傳統(tǒng)中藥板藍根的抗流感病毒有效部位為被強酸型陽離子樹脂吸附部分，此結論在國內外尚未見報道。此發(fā)現(xiàn)為科學評價板藍根制劑的質量提供了新的可靠依據(jù)，也為合理設計板藍根提取、分離工藝，為制取更有效的板藍根制劑提供了切實可行的依據(jù)。