紙層析實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)內(nèi)容及用途

【專家解說】：紙層析法又稱紙色譜法。以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動(dòng)相為不與水相溶的有機(jī)溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點(diǎn)在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開。當(dāng)組分移動(dòng)一定距離后，各組分移動(dòng)距離不同，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。根據(jù)組分移動(dòng)距離（Rf值）與已知樣比較，進(jìn)行定性。用斑點(diǎn)掃描儀或?qū)⒔M分點(diǎn)取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。在環(huán)境分析測試中，有時(shí)用紙層析法分離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC應(yīng)用普遍。紙層析法可分為一般紙層析法，圓形紙層析法、反相紙層析法和雙向紙層析法。等 用途 　　通?？捎糜谌~綠素的色素成分檢驗(yàn)，氨基酸的鑒定及測定，橘皮精油成分檢驗(yàn)及一些特定細(xì)胞篩查等實(shí)驗(yàn)。 原理 　　紙層析法依據(jù)極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴(kuò)散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。 　　試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下對照物質(zhì)對比以確定其異同。作為單體鑒別時(shí)，試樣所顯主色譜斑點(diǎn)的顏色（或熒光）與供置，應(yīng)與對照（標(biāo)準(zhǔn)）樣所顯主色的譜斑點(diǎn)或供試品-對照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點(diǎn)相同。作為質(zhì)量指標(biāo)（純度）檢查時(shí)，可取一定量的試樣，經(jīng)展開后，按各單體的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)或呈色（或熒光）的強(qiáng)度。作為含量測定時(shí)，可將色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后，再用適宜的方法測定，也可用色譜掃描儀測定。 色譜系統(tǒng) 　　固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動(dòng)相為不與水相溶的有機(jī)溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。 編輯本段應(yīng)用 操作方法 　　將試樣點(diǎn)在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開。當(dāng)組分移動(dòng)一定距離后，各組分移動(dòng)距離不同，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。根據(jù)組分移動(dòng)距離（Rf值）與已知樣比較，進(jìn)行定性。用斑點(diǎn)掃描儀或?qū)⒔M分點(diǎn)取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。 應(yīng)用及實(shí)例介紹 　　在環(huán)境分析測試中，有時(shí)用紙層析法分離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC應(yīng)用普遍。在做葉綠體色素分離時(shí)用到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對含量和種類。 　　紙層析法一般用于葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、 [1]葉綠素a、葉綠素b，它們在層析液中的溶解度不同，溶解度大的隨層析液在濾 　　紙上擴(kuò)散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 　　能清楚地將葉綠體中的色素分離。 注意事項(xiàng) 　　紙層析法中所用的有機(jī)溶劑如丙酮等，一般有揮發(fā)性、并有一定毒性，使用時(shí)要注意密封層析，避免吸入過多有害揮發(fā)物。 編輯本段實(shí)驗(yàn) 儀器藥品 　　大試管 臺天平 研缽(配帶孔紙板,防止丙酮揮發(fā)) 量筒 燒杯 漏斗 　　軟木塞 濾紙 丙酮（可用無水乙醇替代） 四氯化碳 無水硫酸鈉 碳酸鈣 石英砂 操作步驟 　　1．稱取新鮮葉子2g，放入研缽中加丙酮5ml，少許碳酸鈣(防止葉綠素被破壞）和石英砂（幫助研磨），研磨成勻漿，再加丙酮5ml，然后以漏斗過濾之，即為色素提取液。 　　2．取準(zhǔn)備好的濾紙條（2×20cm），將其一端剪去兩側(cè)，中間留一長約1.5cm，寬約0.5cm的窄條，并在濾紙剪口上方折疊出一條直線，作為畫濾液細(xì)線的基準(zhǔn)線。 　　3．用毛細(xì)吸管沾少許濾液在折線上描繪4~5次，注意要畫得勻、直、細(xì)，每次畫完細(xì)線要等其自然變干后再畫第二根線。 4．在大試管中加入四氯化碳3梍5ml及少許無水硫酸鈉（即層析液）。然后將濾紙條固定于軟木塞上，插入試管內(nèi)，使窄端浸入溶劑中（色素點(diǎn)要略高于液面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁），蓋緊軟木塞，直立于陰暗處進(jìn)行層析。 　　經(jīng)過0.5—1小時(shí)后，觀察分離后色素帶的分布。最上端橙黃色為胡蘿卜素，其次黃色為葉黃素，再下面藍(lán)綠色為葉綠素a，最后的黃綠色為葉綠素b。[1] 普通高中相關(guān)實(shí)驗(yàn) 　　植物葉綠體中色素的提取與分離 　　用具：剪刀一把、干燥的定性濾紙、50ml的燒杯及100ml的燒杯各3個(gè)、白紙3張、試管架一個(gè)、研缽一個(gè)、玻璃漏斗一個(gè)、尼龍布或紗布、毛細(xì)血管一只、藥勺一個(gè)、10ml量筒一只，天平一只，試管3支、紙板一塊、棉塞3個(gè)、培養(yǎng)皿3個(gè)、刻度尺、注射器一只、蓋玻片 　　試劑：丙酮、無水乙醇、層吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸鈣、碳酸鈉 　　材料：新鮮的菠菜葉、青菜葉、大葉黃楊葉片 　　背景資料： 　　1、 葉綠素等是脂溶性的有機(jī)分子，根據(jù)相似相溶的原理，葉綠素等色素分子溶于有機(jī)溶劑而不溶于有極性的水。故在研磨和收集葉綠色素時(shí)要用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑而不用水。 　　2、 葉綠素分布于基粒的片層薄膜上，加入少許二氧化硅是為了磨碎細(xì)胞壁、質(zhì)膜、葉綠體被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。 　　3、 破碎的細(xì)胞中含有草酸等有機(jī)酸，葉綠素分子中含有的Mg元素處于不穩(wěn)定化合態(tài)，鎂離子與有機(jī)酸結(jié)合將導(dǎo)致色素分子破壞。加入少許碳酸鈣使得鈣離子與有機(jī)酸結(jié)合，減少鎂離子的轉(zhuǎn)移，防止研磨時(shí)葉綠體色素的破壞。所以在研磨時(shí)加入適量的碳酸鈣，同時(shí)加入碳酸鈉的道理亦如此。 　　4、 在過濾時(shí)選用脫脂棉或紗布，而不用濾紙。原因主要有下：（1）色素分子比較大，不容易透過濾紙； （2）濾紙有較強(qiáng)的吸附性而使色素吸附在濾紙上，從而降低色素濃度，影響實(shí)驗(yàn)效果；（3）葉綠素是脂溶性，根據(jù)相似相容的原理，脫脂棉可以減少實(shí)驗(yàn)過程中色素的流失，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)效果。 　　5、 根據(jù)物理學(xué)中的毛細(xì)現(xiàn)象，畫濾紙細(xì)線前濾紙必須經(jīng)過干燥處理，是為了阻止水分子堵塞濾紙中的毛細(xì)管而影響層析液的擴(kuò)散。但如果用火烤的話，會使濾紙纖維變形同時(shí)破壞啦毛細(xì)管，而影響層析液的擴(kuò)散。 　　6、 由于液面的不同位置表面張力不同，紙條接近液面時(shí)，其邊緣的表面的張力較大，層析液沿濾紙邊緣擴(kuò)散過快，而導(dǎo)致色素帶分離不整齊的現(xiàn)象。故而，在插入層析液的濾紙條一端剪去兩個(gè)角。 　　7、 為了防止濾紙條倒入層析液中而使層析實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)，防止因液體表面張力引起層析液沿濾紙條向上的“壁流”而導(dǎo)致色素溶解。 　　8、 色素分離的原理：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動(dòng)相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機(jī)溶劑如乙醇等為流動(dòng)相，色素提取液為層析試樣。把試樣點(diǎn)在濾紙的濾液細(xì)線位置上，當(dāng)流動(dòng)相溶劑在濾紙的毛細(xì)管的作用下，連續(xù)不斷地沿著濾紙前進(jìn)通過濾液細(xì)線時(shí)，試樣中各組份便隨著流動(dòng)相溶劑向前移動(dòng)，并在流動(dòng)相和固定相溶劑之間連續(xù)一次有一次的分配。結(jié)果分配比比較大的物質(zhì)移動(dòng)速度較快，移動(dòng)距離較遠(yuǎn)；分配比較小的物質(zhì)移動(dòng)較慢，移動(dòng)距離較近，試樣中各組分分別聚集在濾紙的不同的位置上，從而達(dá)到分離的目的。