葉綠素乙醇法

【專家解說】：無水乙醇提取是將葉綠體中的葉綠體溶解出來，進(jìn)入溶液，并不能起到分離色素的效果。乙醇提取只是提取方法，不是分離方法。分離是要靠色譜法等方法進(jìn)行分離。 （補(bǔ)充資料）：葉綠素提取 高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a (C55H72O5N4Mg)、葉綠素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡蘿卜素(C40H56)和葉黃素(C40H56O2)等4種。葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，胡蘿卜素是一種橙色天然色素，屬于四萜類，為一長鏈共軛多烯，有α、β、γ三種異構(gòu)體，其中，β異構(gòu)體含量最多。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在乙醚中溶解度較小。根據(jù)它們的化學(xué)特性，可將它們從植物葉片中提取出來，并通過萃取、沉淀和色譜方法將它們分離開來。 2．薄層色譜 薄層層析是快速分離和定性分析微量物質(zhì)的一種極為重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有設(shè)備簡單、操作方便而快速的特點(diǎn)。它是將固定相支持物均勻地鋪在玻片上制成薄層板，將樣品溶液點(diǎn)加在起點(diǎn)處，置于層析容器中用合適的溶劑展開而達(dá)到分離的目的。用此法分離時(shí)幾乎不受溫度的影響，可采用腐蝕性顯色劑，而且可在高溫下顯色，特別適用于揮發(fā)性小或在較高溫度下易發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)，同時(shí)也常用來跟蹤有機(jī)反應(yīng)或監(jiān)測有機(jī)反應(yīng)完成的程度。 薄層層析的器材選擇： （1）基板：玻璃、塑料、金屬箔，常用玻璃板。 （2）吸附劑： 吸附劑要有合適的吸附力，并且必須與展開劑和被吸附物質(zhì)均不起化學(xué)反應(yīng)?？捎米魑絼┑奈镔|(zhì)很多，常用的有硅膠和氧化鋁，由于吸附性好，適用于各類化合物的分離，應(yīng)用最廣。選擇吸附劑時(shí)主要根據(jù)樣品的溶解度、酸堿性及極性。氧化鋁一般是微堿性吸附劑，適用于堿性物質(zhì)及中性物質(zhì)的分離；而硅膠是微酸性吸附劑，適用于酸性物質(zhì)及中性物質(zhì)的分離。以下簡單介紹吸附劑的幾個(gè)基本參數(shù)。 種類：常用：氧化鋁（強(qiáng)極性）、硅膠（中強(qiáng)極性） 不常用：硅藻土、纖維素、糖類、活性碳 符號(hào)：H——無任何添加劑；G——加有鍛石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合劑； F——加有熒光素（Fluorescein） CMC——加有羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose） 例：硅膠GF254表示硅膠中既加有煅石膏粘合劑，也加有熒光素，可以在波長254nm的紫外光下激發(fā)出熒光 粒度：目：1cm2內(nèi)的篩孔數(shù)，數(shù)目越大，顆粒越小。薄層所用吸附劑顆粒較細(xì)，氧化鋁為200目，硅膠為100~150目。 μ：顆粒的平均直徑，以微米表示。例如：40μ的顆粒與100目相當(dāng)。 活性： 吸附劑按其含水量的多少各分為五個(gè)等級：I級含水量最少，活性最高；V級含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分離效果越好，選用哪種活性級別的吸附劑，要用實(shí)驗(yàn)的方法來確定。 酸堿性： 市售氧化鋁有酸性（用以分離酸性化合物）、中性、堿性（用以分離生物堿等堿性化合物），其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、9—10；其中以中性氧化鋁應(yīng)用最廣，可用來分離各種化合物，特別是那些對酸、堿敏感的化合物。 硅膠沒有酸堿性之分。 （3）展開劑 在樣品組分-吸附劑-展開劑三個(gè)因素中。對一確定組分，樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可看作是一不變因素，吸附劑和展開劑是可變因素。而吸附劑的種類有限，因此選擇合適的展開劑就成為解決問題的關(guān)鍵。展開劑的選擇有以下要求: （a）對待測組分有很好的溶解度。 （b）能使待測組分與雜質(zhì)分開，與基線分離。 （c）使展開后的組分斑點(diǎn)圓而集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象。 （d）使待測組分的Rf值最好在0.4~0.5，如樣品中待測組分較多，Rf值則可在0.25~0.75范圈內(nèi)，組分間的Rf值最好相差0.1左右。由于薄層色譜法用途非常廣泛，國內(nèi)外均有現(xiàn)成的鋪有吸附劑的薄層板出售。一般實(shí)驗(yàn)室中也可自己制備。 (e)不與組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或在某些吸附劑存在下發(fā)生聚合。 (f)具有適中的沸點(diǎn)和較低的粘滯度。 展開劑的極性是指與樣品組分相互作用時(shí)。展開劑分子與吸附劑分子的色散作用、偶極作用、氫鍵作用及介電作用的總和。展開劑要根據(jù)樣品的極性及溶解度，吸附劑活性等因素進(jìn)行選擇，總的原則是展開劑的極性能使組分的Rf值在0.5左右。常用溶劑極性次序是：石油醚<環(huán)己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。 如一種溶劑不能充分展開，可選用二元或多元溶劑系統(tǒng)。 4．展開槽與展開： 薄層的展開在密閉的容器即展開槽或稱為層析缸中進(jìn)行。 展開： 合適的展開劑用量為浸及下端硅膠，但不浸及樣點(diǎn)；點(diǎn)樣端向下，每次只展開一塊，放在正中，以免爬斜（進(jìn)而展開傾斜）。 5．顯色： 如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點(diǎn)。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點(diǎn)（有苯環(huán)的物質(zhì)都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點(diǎn)的位置；對于在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點(diǎn)（因?yàn)樵S多化合物都能和碘成黃棕色斑點(diǎn)），顯色后，立即用鉛筆標(biāo)出斑點(diǎn)的位置。常用 普適性顯色劑：濃硫酸、碘蒸氣、熒光素，專用顯色劑：茚三酮、三氯化鐵溶液等。 三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品 儀器：半微量玻璃儀器一箱，小燒杯，層析缸(槽)，載玻片(100mm×25mm)干燥器，電吹風(fēng)，毛細(xì)管，移液管，研缽，布氏漏斗，抽濾裝置。 試劑：硅膠，1％ CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，飽和NaCl溶液，無水Na2SO4 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．制板： 將硅膠加 1％ CMC，調(diào)成槳狀(硅膠：CMC=1:3~4)（在平鋪玻璃板上能晃動(dòng)但不能流動(dòng)），將其涂在載玻片上（100mm×25mm）），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動(dòng)，至平坦為止，放在干凈平坦的臺(tái)面上，晾干之后放入105℃烘箱活化1小時(shí)，取出放入干燥器內(nèi)待用。 2、葉綠素的提取 在研缽中放入幾片(約5g)菠菜葉(新鮮的或冷凍的都可以．如果是冷凍的，解凍后包在紙中輕壓吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，適當(dāng)研磨。將提取液用滴管轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加人10 mL飽和NaCl溶液(防止生成乳濁液)除去水溶性物質(zhì)，分去H2O層，再用蒸餾水洗滌兩次。將有機(jī)層轉(zhuǎn)入干燥的小錐形瓶中，加2g入無水Na2SO4干燥。干燥后的液體傾至另—錐形瓶中(如溶液顏色太淺，可在通風(fēng)柜中適當(dāng)蒸發(fā)濃縮)。 3、點(diǎn)樣 用一根內(nèi)徑 1mm的毛細(xì)管，吸取適量提取液，輕輕地點(diǎn)在距薄板一端1.5cm處，平行點(diǎn)兩點(diǎn)，兩點(diǎn)相距1cm左右。若一次點(diǎn)樣不夠，可待樣品溶劑揮發(fā)后．再在原處點(diǎn)第二次，但點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不得越過2mm。 4、展開 先在層析缸中放入展開劑[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(體積比為3:1:1)]，加蓋使缸內(nèi)蒸氣飽10min， 再將薄層板斜靠于層析缸內(nèi)壁。點(diǎn)樣端接觸展開劑但樣點(diǎn)不能浸沒于展開劑中，密閉層祈缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1crm時(shí)，取出平放，用鉛筆或小針劃前沿線位置，晾干或用電吹風(fēng)吹干薄層。 五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1．制板時(shí)用注意使板上硅膠厚度盡量一致。 2．植物葉片不要研成糊狀，否則會(huì)給分離造成困難