怎樣用紙層析法測定胡蘿卜素?
來源:新能源網(wǎng)
時(shí)間:2024-08-17 10:43:46
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怎樣用紙層析法測定胡蘿卜素?【專家解說】: 樓主你好:
胡蘿卜素是維生素A前體,可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A。結(jié)構(gòu)上分為曠,p和r胡蘿卜素三種形式。天然胡蘿卜素主要來源于植物,如胡蘿卜
【專家解說】: 樓主你好:
胡蘿卜素是維生素A前體,可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A。結(jié)構(gòu)上分為曠,p和r胡蘿卜素三種形式。天然胡蘿卜素主要來源于植物,如胡蘿卜、綠葉蔬菜等,其中以p胡蘿卜素含量最高,活性最強(qiáng)。胡蘿卜素本身是一種色素,在450:nm波長處有最大吸收,故只要能完全分離,便可定性和定量。但在植物體內(nèi),胡蘿卜素經(jīng)常與葉綠素、葉黃素等共存,在提取p胡蘿卜素時(shí),這些色素也能被有機(jī)溶劑提取,因此在測定前,必須將胡蘿卜素與其他色素分開。常用的方法有紙層析、柱層析和薄層層析法。
胡蘿卜素的測定
胡蘿卜素是維生素A前體,可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A。結(jié)構(gòu)上分為曠,p和r胡蘿卜素三種形式。天然胡蘿卜素主要來源于植物,如胡蘿卜、綠葉蔬菜等,其中以p胡蘿卜素含量最高,活性最強(qiáng)。胡蘿卜素本身是一種色素,在450:nm波長處有最大吸收,故只要能完全分離,便可定性和定量。但在植物體內(nèi),胡蘿卜素經(jīng)常與葉綠素、葉黃素等共存,在提取p胡蘿卜素時(shí),這些色素也能被有機(jī)溶劑提取,因此在測定前,必須將胡蘿卜素與其他色素分開。常用的方法有紙層析、柱層析和薄層層析法。
紙層析法
1.原理
以丙酮和石油醚提取食物中的胡蘿卜素及其他植物色素,以石油醚為展開劑進(jìn)行紙層析,胡蘿卜素極性最小,移動速度最快,從而與其他色素分開。剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶,洗脫后于450 nm波長下進(jìn)行比色測定。
2.儀器
①玻璃層析缸。
②分光光度計(jì)。
③旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,具150 mL球形瓶。
④恒溫水浴鍋。
⑤皂化回流裝置。
⑥點(diǎn)樣器或微量注射器。
⑦濾紙。
3.試劑
①石油醚(沸程30~60℃)。
②丙酮。
③丙酮一石油醚混合液:3:7(WV)。
④無水硫酸鈉(分析純)。
⑤5%硫酸鈉溶液(M/V)。
⑥1:1氫氧化鉀溶液(M/、/r)。
⑦無水乙醇:需脫醛處理,方法同比色法測定維生素A試劑。
⑧胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液:取5 mg p胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品,溶于10 mL三氯甲烷中,濃度約為500Ug?mI標(biāo)定:吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液10肚I。,加正己烷3.00 mI。,混勻。用1 cm比色皿,以正己烷為空白,在450 nm波長下測定吸光值,平行測定3份,取平均值。
4.測定步驟
①樣品提取與洗滌
a.糧食用水洗3次,置60℃烤箱中烤干,磨粉,貯于塑料瓶中,放一小包樟腦精,蓋緊瓶塞保存,備用。
b.蔬菜與其他植物性食品取可食部分用水洗3次后,用紗布吸去水滴,打成勻漿。取適量磨細(xì)或打成勻漿的樣品(含胡蘿卜素20~80肛g)置于1。0 mI。帶塞的錐形瓶中,加人20 mL丙酮、5 mI。石油醚,振搖1 min,靜止5 min,將提取液轉(zhuǎn)人盛有100 mL 5%硫酸鈉溶液的分液漏斗中。之后再用10 mI,丙酮一石油醚混合溶液提取2~3次,直至提取液無色為止。將所有提取液并人分液漏斗中,靜止分層,棄去下層水溶液,用15 mI。5%硫酸鈉振搖洗滌數(shù)次,至水層不再混濁。
c.植物油和高脂肪樣品:提取前需要進(jìn)行皂化。取1~10 g樣品,加乙醇30 mI。,l:1氫氧化鉀10 mL,加熱回流30 min,取出放人冰水中速冷。用石油醚提取皂化液,用水洗滌至中性。
②濃縮與定容:將石油醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉(約5 g)濾人與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250~300 mI一球形蒸發(fā)瓶內(nèi),用約10 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次,洗液并人蒸發(fā)瓶內(nèi),接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,于55℃水浴中減壓蒸餾回收石油醚。待瓶中剩下約2 mI。石油醚時(shí),取下蒸發(fā)瓶,用氮?dú)鉀_干。立即加入2.00 mI。石油醚定容。
③紙層析
a.點(diǎn)樣:在圖10一1的濾紙下端距底邊4 cm處作一基線,在基線上取A、B、C、D四點(diǎn)。吸取O.100~O.4。0 mL(隨胡蘿卜素含量而定,估計(jì)吸光值在0.1~O.7之間)樣品濃縮液在AB兩點(diǎn)之間和CD兩點(diǎn)之間迅速來回進(jìn)行帶狀點(diǎn)樣,一次點(diǎn)完。
b.展開:待紙上所點(diǎn)樣液自然揮發(fā)至干后,將濾紙卷成圓筒狀,將兩邊連接固定,基線處于紙筒底端。(更多詳細(xì)咨詢請參考國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)www.rmhot.com)置于預(yù)先用石油醚飽和過的層析缸內(nèi),上行展開(層析缸應(yīng)事先用石油醚飽和,并且防止水分進(jìn)入)。
c.洗脫:待胡蘿卜素與其他色素完全分離后,取出濾紙,石油醚自然揮發(fā)至干。剪下位于展開劑前沿的胡蘿卜素層析帶,立即放人盛有5 mL石油醚的具塞試管中,用力振搖,使胡蘿卜素完全溶入溶劑中
④比色測定:用1 cm比色皿,以石油醚調(diào)節(jié)零點(diǎn),于450 nm波長下測定吸光度,以其值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)伊胡蘿卜素的含量。
⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?。簆一胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)使用液(50弘g/mI。)1.00,2.OO,3.00,4.00,6.00,8.00 mI。,分別置于100 mL具塞錐形瓶內(nèi),按樣品測定步驟進(jìn)行提取、洗滌、紙層析等操作,點(diǎn)樣體積為0.100 mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)胡蘿卜素含量依次為2.50、5.00、7.50、10.OO、15.00、20.00 pg。為測定低含量樣品,可在0~2.50弘g加做幾點(diǎn)。以胡蘿卜素含量為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.計(jì)算
6.說明
①此法為國家標(biāo)準(zhǔn)方法,方法簡便,色帶清晰,最小檢出限為O.11Ug。
②所有的操作步驟都需在避光條件下進(jìn)行。
③濃縮提取液時(shí),一定要防止蒸干,避免胡蘿卜素在空氣中氧化或因高溫、紫外線直射等破壞。定容、點(diǎn)樣、層析后剪樣點(diǎn)等操作環(huán)節(jié)一定要迅速.
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