怎樣用紙層析法測定胡蘿卜素?

【專家解說】：樓主你好: 胡蘿卜素是維生素A前體，可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A。結(jié)構(gòu)上分為曠，p和r胡蘿卜素三種形式。天然胡蘿卜素主要來源于植物，如胡蘿卜、綠葉蔬菜等，其中以p胡蘿卜素含量最高，活性最強。胡蘿卜素本身是一種色素，在450:nm波長處有最大吸收，故只要能完全分離，便可定性和定量。但在植物體內(nèi)，胡蘿卜素經(jīng)常與葉綠素、葉黃素等共存，在提取p胡蘿卜素時，這些色素也能被有機溶劑提取，因此在測定前，必須將胡蘿卜素與其他色素分開。常用的方法有紙層析、柱層析和薄層層析法。 胡蘿卜素的測定 胡蘿卜素是維生素A前體，可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A。結(jié)構(gòu)上分為曠，p和r胡蘿卜素三種形式。天然胡蘿卜素主要來源于植物，如胡蘿卜、綠葉蔬菜等，其中以p胡蘿卜素含量最高，活性最強。胡蘿卜素本身是一種色素，在450:nm波長處有最大吸收，故只要能完全分離，便可定性和定量。但在植物體內(nèi)，胡蘿卜素經(jīng)常與葉綠素、葉黃素等共存，在提取p胡蘿卜素時，這些色素也能被有機溶劑提取，因此在測定前，必須將胡蘿卜素與其他色素分開。常用的方法有紙層析、柱層析和薄層層析法。 紙層析法 1.原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡蘿卜素及其他植物色素，以石油醚為展開劑進(jìn)行紙層析，胡蘿卜素極性最小，移動速度最快，從而與其他色素分開。剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450 nm波長下進(jìn)行比色測定。 2.儀器 ①玻璃層析缸。 ②分光光度計。 ③旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，具150 mL球形瓶。 ④恒溫水浴鍋。 ⑤皂化回流裝置。 ⑥點樣器或微量注射器。 ⑦濾紙。 3.試劑 ①石油醚(沸程30~60℃)。 ②丙酮。 ③丙酮一石油醚混合液:3:7(WV)。 ④無水硫酸鈉(分析純)。 ⑤5%硫酸鈉溶液(M/V)。 ⑥1:1氫氧化鉀溶液(M/、/r)。 ⑦無水乙醇:需脫醛處理，方法同比色法測定維生素A試劑。 ⑧胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液:取5 mg p胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mL三氯甲烷中，濃度約為500Ug??mI標(biāo)定:吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液10肚I。，加正己烷3.00 mI。，混勻。用1 cm比色皿，以正己烷為空白，在450 nm波長下測定吸光值，平行測定3份，取平均值。 4.測定步驟 ①樣品提取與洗滌 a.糧食用水洗3次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，貯于塑料瓶中，放一小包樟腦精，蓋緊瓶塞保存，備用。 b.蔬菜與其他植物性食品取可食部分用水洗3次后，用紗布吸去水滴，打成勻漿。取適量磨細(xì)或打成勻漿的樣品(含胡蘿卜素20~80肛g)置于1。0 mI。帶塞的錐形瓶中，加人20 mL丙酮、5 mI。石油醚，振搖1 min，靜止5 min，將提取液轉(zhuǎn)人盛有100 mL 5%硫酸鈉溶液的分液漏斗中。之后再用10 mI，丙酮一石油醚混合溶液提取2~3次，直至提取液無色為止。將所有提取液并人分液漏斗中，靜止分層，棄去下層水溶液，用15 mI。5%硫酸鈉振搖洗滌數(shù)次，至水層不再混濁。 c.植物油和高脂肪樣品:提取前需要進(jìn)行皂化。取1~10 g樣品，加乙醇30 mI。，l:1氫氧化鉀10 mL，加熱回流30 min，取出放人冰水中速冷。用石油醚提取皂化液，用水洗滌至中性。 ②濃縮與定容:將石油醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉(約5 g)濾人與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250~300 mI一球形蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約10 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次，洗液并人蒸發(fā)瓶內(nèi)，接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，于55℃水浴中減壓蒸餾回收石油醚。待瓶中剩下約2 mI。石油醚時，取下蒸發(fā)瓶，用氮氣沖干。立即加入2.00 mI。石油醚定容。 ③紙層析 a.點樣:在圖10一1的濾紙下端距底邊4 cm處作一基線，在基線上取A、B、C、D四點。吸取O.100~O.4。0 mL(隨胡蘿卜素含量而定，估計吸光值在0.1~O.7之間)樣品濃縮液在AB兩點之間和CD兩點之間迅速來回進(jìn)行帶狀點樣，一次點完。 b.展開:待紙上所點樣液自然揮發(fā)至干后，將濾紙卷成圓筒狀，將兩邊連接固定，基線處于紙筒底端。(更多詳細(xì)咨詢請參考國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)www.rmhot.com)置于預(yù)先用石油醚飽和過的層析缸內(nèi)，上行展開(層析缸應(yīng)事先用石油醚飽和，并且防止水分進(jìn)入)。 c.洗脫:待胡蘿卜素與其他色素完全分離后，取出濾紙，石油醚自然揮發(fā)至干。剪下位于展開劑前沿的胡蘿卜素層析帶，立即放人盛有5 mL石油醚的具塞試管中，用力振搖，使胡蘿卜素完全溶入溶劑中 ④比色測定:用1 cm比色皿，以石油醚調(diào)節(jié)零點，于450 nm波長下測定吸光度，以其值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)伊胡蘿卜素的含量。 ⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取:p一胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)使用液(50弘g/mI。)1.00，2.OO，3.00，4.00，6.00，8.00 mI。，分別置于100 mL具塞錐形瓶內(nèi)，按樣品測定步驟進(jìn)行提取、洗滌、紙層析等操作，點樣體積為0.100 mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線各點胡蘿卜素含量依次為2.50、5.00、7.50、10.OO、15.00、20.00 pg。為測定低含量樣品，可在0~2.50弘g加做幾點。以胡蘿卜素含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.計算 6.說明 ①此法為國家標(biāo)準(zhǔn)方法，方法簡便，色帶清晰，最小檢出限為O.11Ug。 ②所有的操作步驟都需在避光條件下進(jìn)行。 ③濃縮提取液時，一定要防止蒸干，避免胡蘿卜素在空氣中氧化或因高溫、紫外線直射等破壞。定容、點樣、層析后剪樣點等操作環(huán)節(jié)一定要迅速.