利用甲烷氧化混合菌生物合成聚β-羥基丁酸酯

【摘要】：聚p-羥基丁酸酯(PHB)是大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)碳源和能源的儲(chǔ)備物,具有生物可降解性,熱塑性,且透氧率低,用作食品包裝用膜、袋,飲料用包裝內(nèi)襯層和生鮮食品盤等,更利于食品的儲(chǔ)藏運(yùn)輸,在食品包裝領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,日益受到人們的關(guān)注。目前,PHB的商業(yè)化生產(chǎn)主要基于野生菌和基因工程菌的純菌種發(fā)酵工藝,嚴(yán)格控制的無菌底物和生產(chǎn)環(huán)境導(dǎo)致了較高的生產(chǎn)成本,從而限制了生物塑料PHB的大規(guī)模應(yīng)用,特別是在食品包裝中的應(yīng)用。富集高產(chǎn)PHB、組成穩(wěn)定的混合菌在開放條件下,以甲烷甲醇等一碳化合物生產(chǎn)PHB成為目前實(shí)現(xiàn)PHB在食品包裝領(lǐng)域中規(guī)?；瘧?yīng)用最具前景的研究課題。 本學(xué)位論文利用從黑龍江省大慶油田富含沼氣地區(qū)的土壤中培養(yǎng)篩選獲得的甲烷氧化混合菌,以甲烷為碳源通過好氧瞬時(shí)供料方式(充盈-饑餓交替),篩選掉其中PHB含量少的菌株,對(duì)菌群中開放條件下穩(wěn)定高產(chǎn)PHB的甲烷氧化菌進(jìn)行了富集。通過甲烷氧化混合菌的結(jié)構(gòu)解析,對(duì)菌群中分離純化的非甲烷氧化菌和甲烷氧化菌的生長(zhǎng)和催化性能的初步探索,以及優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,高密度甲烷氧化混合菌發(fā)酵培養(yǎng)方式的探索,建立了開放條件下以廉價(jià)碳源穩(wěn)定合成PHB的方法。 (1)根據(jù)甲烷氧化混合菌細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律,建立基于Logistic模型的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型： 經(jīng)對(duì)比驗(yàn)證結(jié)果表明,對(duì)于不同的培養(yǎng)條件,該動(dòng)力學(xué)模型對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)密度(用吸光度OD600表示)的計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值之間都具有較好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)均達(dá)到92%以上。這表明應(yīng)用" Logistic模型”建立的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)甲烷氧化混合菌具有較好的適用性,可以進(jìn)行實(shí)際工作中的模擬研究,該模型中各參數(shù)和特征值隨培養(yǎng)條件而變化,適用于發(fā)酵條件優(yōu)化控制,為后續(xù)細(xì)胞高密度培養(yǎng)提供指導(dǎo)。 (2)采用充盈-饑餓(feast-famine cycle)模式間歇供料,以甲烷為底物好氧開放式培養(yǎng)甲烷氧化混合菌,利用蘇丹黑染色法動(dòng)態(tài)檢測(cè)充盈和饑餓階段胞內(nèi)PHB含量變化,實(shí)現(xiàn)了菌群中高PHB存儲(chǔ)能力的甲烷氧化菌的富集和穩(wěn)定傳代。結(jié)果顯示,在充分供氧條件下,充盈培養(yǎng)5d,饑餓培養(yǎng)15d,循環(huán)培養(yǎng)5次,PHB含量從10.8%增加到36.6%,且富集后甲烷氧化混合菌經(jīng)過開放條件下連續(xù)傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)和PHB合成穩(wěn)定,表明甲烷氧化混合菌具有菌群組成穩(wěn)定性,適于PHB工業(yè)化生產(chǎn)。 (3)通過對(duì)富集后的甲烷氧化混合菌進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)生長(zhǎng)特性分析,推測(cè)了混合菌體系中不同微生物間的協(xié)同作用機(jī)理：甲基彎菌JW和JC能以甲烷、甲醇作為碳源生長(zhǎng),并為伴生菌提供從甲烷、甲醇得到的代謝碳供伴生菌生長(zhǎng),伴生菌的存在可以及時(shí)利用代謝中間產(chǎn)物有效避免產(chǎn)物抑制,同時(shí)為甲基彎菌JW和JC提供生長(zhǎng)因子,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。甲烷氧化混合菌分離出來的重要成員甲基彎菌JC能高效利用甲醇生長(zhǎng),能增強(qiáng)甲烷氧化混合菌對(duì)甲醇的耐受性,促使混合菌體系無需馴化直接利用甲醇為碳源生長(zhǎng),避免由于甲烷在培養(yǎng)基中溶解度低而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)慢的問題,為高密度培養(yǎng)打下基礎(chǔ)?；谖锓N間的自然選擇和競(jìng)爭(zhēng),以碳饑餓作為選擇壓力,通過甲烷為碳源短期充盈(5d)長(zhǎng)期饑餓(15d)循環(huán)交替的富集方式,形成了能長(zhǎng)期耐受碳饑餓的高PHB存儲(chǔ)能力的甲烷氧化菌-伴生菌共生的微生態(tài)系統(tǒng),其在開放條件下也不易受到雜菌的污染,更具環(huán)境適應(yīng)性而長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)并積累PHB。 (4)在掌握了細(xì)胞的基本生長(zhǎng)規(guī)律和胞內(nèi)PHB積累能力的基礎(chǔ)上,利用富集后的甲烷氧化混合菌以廉價(jià)碳源甲烷、甲醇生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì),通過調(diào)整碳源供給、培養(yǎng)基組成等手段優(yōu)化胞外生長(zhǎng)環(huán)境促進(jìn)胞內(nèi)PHB積累,以少量甲醇的加入在原有基礎(chǔ)上大幅提高了細(xì)胞產(chǎn)量及胞內(nèi)PHB的積累能力。對(duì)營(yíng)養(yǎng)平衡-營(yíng)養(yǎng)受限兩階段培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在相同的碳源補(bǔ)加方式下,優(yōu)化后的營(yíng)養(yǎng)平衡(培養(yǎng)6d)-營(yíng)養(yǎng)受限(培養(yǎng)6d)的兩段式培養(yǎng)方式不僅可以明顯提高PHB的含量,最高可達(dá)61.5%,而且并沒有完全抑制細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞干重達(dá)到1.35g/L,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)密度和單位細(xì)胞PHB積累量的提高,在一定程度上解決了細(xì)胞生長(zhǎng)與PHB積累的矛盾。 (5)甲烷氧化混合菌可在開放條件下利用甲醇代替甲烷做為唯一碳源生長(zhǎng)并在細(xì)胞內(nèi)合成PHB,且甲醇能夠較大程度的促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和PHB的胞內(nèi)積累。通過對(duì)富集后甲烷氧化混合菌在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究,以延滯期和最大比增長(zhǎng)速度為依據(jù),對(duì)發(fā)酵罐的碳源補(bǔ)加量和補(bǔ)加方式進(jìn)行優(yōu)化,建立提高PHB產(chǎn)量為目的甲醇流加策略,通過分批補(bǔ)加不同濃度碳源(甲醇),解除高濃度甲醇的抑制作用,為菌體生長(zhǎng)和PHB的胞內(nèi)合成提供適宜的碳源利用環(huán)境,從而明顯縮短發(fā)酵時(shí)間,提高甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB的積累量。根據(jù)發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律,建立了開放條件下一段式的發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)PHB的方法,簡(jiǎn)化了操作步驟,提高了生產(chǎn)效率。經(jīng)過10d的分批發(fā)酵培養(yǎng),細(xì)胞干重可達(dá)3.1g/L, PHB含量提升至78.4%。 【關(guān)鍵詞】：聚β-羥基丁酸酯(PHB) 甲烷氧化混合菌 開放式 充盈-饑餓模式 富集
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：TQ929;TS206.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-18
• 1 緒論18-36
• 1.1 引言18-19
• 1.2 PHB概述19-24
• 1.2.1 聚羥基鏈烷酸(PHAs)的結(jié)構(gòu)和分類19-20
• 1.2.2 PHB的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀20-21
• 1.2.3 PHB的結(jié)構(gòu)、特性及應(yīng)用21-22
• 1.2.4 PHB生物合成途徑22-24
• 1.2.5 PHB的生物降解24
• 1.3 合成PHB的研究現(xiàn)狀24-34
• 1.3.1 利用微生物生產(chǎn)PHB24-33
• 1.3.2 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)PHB33
• 1.3.3 化學(xué)法合成PHB33-34
• 1.4 本論文的研究思路34-36
• 1.4.1 研究背景意義及存在問題34
• 1.4.2 立題依據(jù)和可行性分析34
• 1.4.3 主要研究?jī)?nèi)容34-36
• 2 甲烷氧化混合菌的生長(zhǎng)特性與PHB的積累36-52
• 2.1 引言36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器36-37
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器37
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 2.3.1 培養(yǎng)基組成及菌種來源37-38
• 2.3.2 以甲烷為唯一碳源進(jìn)行搖瓶開放式培養(yǎng)38
• 2.3.3 以甲醇為碳源進(jìn)行搖瓶開放式培養(yǎng)38
• 2.3.4 甲烷氣氛下添加甲醇進(jìn)行搖瓶開放式培養(yǎng)38
• 2.3.5 其他碳源供給下進(jìn)行搖瓶開放式培養(yǎng)38-39
• 2.3.6 不同Cu~(2+)濃度下進(jìn)行搖瓶開放式培養(yǎng)39
• 2.4 分析與檢測(cè)39-41
• 2.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定39
• 2.4.2 PHB的分析提取檢測(cè)39-40
• 2.4.3 總MMO酶活的測(cè)定40-41
• 2.5 結(jié)果與討論41-51
• 2.5.1 甲烷氧化混合菌中PHB的檢測(cè)分析41-42
• 2.5.2 甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB檢測(cè)方法的改進(jìn)42-43
• 2.5.3 甲烷氧化混合菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立及驗(yàn)證43-45
• 2.5.4 甲醇培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響45-47
• 2.5.5 甲烷氧化混合菌的底物專一性47-49
• 2.5.6 Cu~(2+)濃度對(duì)甲烷氧化混合菌的影響49-51
• 2.6 本章小結(jié)51-52
• 3 高PHB存儲(chǔ)能力甲烷氧化混合菌的富集52-62
• 3.1 引言52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器52-53
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器53
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法53
• 3.3.1 培養(yǎng)基配方及菌種來源53
• 3.3.2 開放條件下以甲烷為唯一碳源進(jìn)行充盈階段搖瓶培養(yǎng)53
• 3.3.3 開放條件下進(jìn)行饑餓階段搖瓶培養(yǎng)53
• 3.4 分析與檢測(cè)53-54
• 3.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定53-54
• 3.4.2 細(xì)胞積累PHB的形態(tài)觀察54
• 3.4.3 PHB的分析提取檢測(cè)54
• 3.4.4 總MMO酶活的測(cè)定54
• 3.5 結(jié)果與討論54-60
• 3.5.1 蘇丹黑染色快速檢測(cè)法54-55
• 3.5.2 充盈-饑餓富集方式的確立55-58
• 3.5.3 富集后甲烷氧化混合菌的特性58-60
• 3.6 本章小結(jié)60-62
• 4 甲烷氧化混合菌的分離純化及其相互作用機(jī)理62-76
• 4.1 引言62
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器62-63
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 4.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器63
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法63-65
• 4.3.1 菌種來源與培養(yǎng)基組成63
• 4.3.2 以甲烷為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)63-64
• 4.3.3 顯微鏡觀察64
• 4.3.4 菌種分離純化64
• 4.3.5 MMO活性檢測(cè)方法64
• 4.3.6 甲醇檢測(cè)64
• 4.3.7 16S rDNA序列分析64
• 4.3.8 PHB的檢測(cè)分析64-65
• 4.4 結(jié)果與討論65-74
• 4.4.1 甲烷氧化混合菌的微生物菌群分析65-71
• 4.4.2 甲烷氧化混合菌中微生物的協(xié)同作用機(jī)理71-74
• 4.5 本章小結(jié)74-76
• 5 提高甲烷氧化混合菌的PHB產(chǎn)量條件的優(yōu)化76-90
• 5.1 前言76-77
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器77-78
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料77
• 5.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器77-78
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法78-79
• 5.3.1 菌種來源與培養(yǎng)基組成78
• 5.3.2 培養(yǎng)基不同組分初始濃度的影響作用78
• 5.3.3 不同生長(zhǎng)期對(duì)PHB積累的影響78
• 5.3.4 PHB的檢測(cè)分析78-79
• 5.4 結(jié)果與討論79-89
• 5.4.1 培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素的影響作用79-83
• 5.4.2 優(yōu)化的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)和PHB積累83-84
• 5.4.3 不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)細(xì)胞積累PHB的影響84-89
• 5.5 本章小結(jié)89-90
• 6 甲烷氧化混合菌的高效發(fā)酵工藝90-104
• 6.1 引言90-91
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器91
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料91
• 6.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器91
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法91-94
• 6.3.1 菌種來源及培養(yǎng)基組成91-92
• 6.3.2 不同碳源條件下發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)92
• 6.3.3 模擬連續(xù)發(fā)酵方式培養(yǎng)細(xì)胞92-93
• 6.3.4 發(fā)酵過程的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)考察93
• 6.3.5 分批發(fā)酵培養(yǎng)中甲醇的流加方式93-94
• 6.4 結(jié)果與討論94-102
• 6.4.1 不同碳源條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)和PHB積累94-95
• 6.4.2 模擬連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)方式的細(xì)胞生長(zhǎng)與PHB積累研究95-97
• 6.4.3 甲醇為唯一碳源條件下的分批發(fā)酵培養(yǎng)97-99
• 6.4.4 甲醇流加方式的建立99-101
• 6.4.5 一段式高效生產(chǎn)PHB的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)體系的建立101-102
• 6.5 本章小結(jié)102-104
• 結(jié)論104-105
• 創(chuàng)新點(diǎn)105-106
• 參考文獻(xiàn)106-122
• 附錄122-124
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文124-126
• 致謝126

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