反硝化型甲烷厭氧氧化微生物的富集培養(yǎng)研究

【摘要】：反硝化型甲烷厭氧氧化(Denitrifying anaerobic methane oxidation, DAMO)是一種新發(fā)現(xiàn)的微生物反應(yīng),催化該過程的微生物——NC10門細(xì)菌,能夠耦聯(lián)甲烷的厭氧氧化和NO3-/NO2的還原。DAMO過程連接了碳素循環(huán)和氮素循環(huán),豐富了生物地球化學(xué)循環(huán)途徑；NC10門細(xì)菌形態(tài)特殊,并且具有獨特的代謝途徑,擴(kuò)充了微生物學(xué)內(nèi)容；DAMO作用能同時去除甲烷與NO3-/NO2兩種污染物,是環(huán)境工程領(lǐng)域新型除碳脫氮工藝開發(fā)的理想選擇。然而,NC10門細(xì)菌生長極其緩慢,要獲得DAMO富集培養(yǎng)物十分困難。接種物、培養(yǎng)基和反應(yīng)器構(gòu)型是微生物富集培養(yǎng)的三個關(guān)鍵因素,本論文分別從這三個方面入手,對DAMO微生物的富集培養(yǎng)進(jìn)行了優(yōu)化研究,主要結(jié)論如下： 1)比較了不同接種物富集培養(yǎng)DAMO微生物的差異,明確了DAMO微生物富集培養(yǎng)的最優(yōu)接種物。 ①測試了厭氧產(chǎn)甲烷顆粒污泥、農(nóng)田水稻土壤和淡水河道沉積物作為接種物的可行性,比較了富集培養(yǎng)過程中NC10門細(xì)菌數(shù)量的變化和DAMO活性的差異,其中富集結(jié)束時NC10門細(xì)菌的數(shù)量分別較接種物增加了63倍、2909倍和198倍,獲得的富集培養(yǎng)物的DAMO活性分別為0.06mgN·g-1VSS·h-1、0.15mgN·g-1VSS·h-1和0.11mgN·g-1VSS·h-1,表明了三種接種物經(jīng)富集均可獲得DAMO富集培養(yǎng)物,均適宜作為DAMO微生物富集培養(yǎng)的接種物,擴(kuò)大了DAMO接種物的來源,為DAMO富集培養(yǎng)物的獲得提供了新的選擇。 ②首次利用農(nóng)田水稻土壤作為接種物成功獲得了DAMO富集培養(yǎng)物,活性實驗及分子生物學(xué)分析結(jié)果均表明農(nóng)田水稻土壤是三者中最優(yōu)接種物。 2)比較了天然培養(yǎng)基與人工培養(yǎng)基在DAMO微生物富集培養(yǎng)效果上的差異,得出了DAMO微生物富集培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。 ①比較了天然培養(yǎng)基與人工培養(yǎng)基富集培養(yǎng)DAMO微生物的差異,獲得的富集培養(yǎng)物的DAMO活性分別為0.02mgN·g-1VSS·h-1和0.11mgN·g-1VSS·h-1,人工培養(yǎng)基是天然培養(yǎng)基的5.5倍；NC10門細(xì)菌的數(shù)量分別為1.01×108copies·g-1(dry soil)和2.01×108copies·g-1(dry soil),后者是前者的兩倍,從而表明了以農(nóng)田水稻土壤作為接種物,人工培養(yǎng)基較天然培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)效果更好。 ②采用農(nóng)田水稻土壤作為接種物,以人工培養(yǎng)基培養(yǎng)成功富集到了以groupB的NC10細(xì)菌為主導(dǎo)的DAMO富集培養(yǎng)物,首次證明了歸屬于group B的NC10細(xì)菌同樣具有DAMO活性。 3)比較了不同構(gòu)型反應(yīng)器富集培養(yǎng)DAMO微生物的能力,得出了DAMO微生物富集培養(yǎng)的最優(yōu)反應(yīng)器構(gòu)型。 ①比較了三種不同構(gòu)型的反應(yīng)器,即磁攪氣升式反應(yīng)器(Magnetic stirred air lift reactor, MSALR)、生物膜反應(yīng)器(Biofilm reactor, BR)和序批式反應(yīng)器(Sequencing batch reactor, SBR)富集培養(yǎng)DAMO微生物的差異。經(jīng)過近一個月的富集培養(yǎng),三者的容積氮去除速率分別提高了827.10%、302.92%和154.09%,DAMO活性分別為0.52mgN·g-1VSS·h-1,0.23mgN·g-1VSS·h-1和0.26mg N·g-1VSS·h-1,表明了三種構(gòu)型裝置均具有提高DAMO活性的功能,均能夠作為DAMO微生物的富集培養(yǎng)裝置。 ②MSALR具有最高的容積氮去除速率和最大的DAMO活性,因此是三者中最優(yōu)的富集培養(yǎng)DAMO微生物的反應(yīng)裝置。 ③從甲烷傳質(zhì)和微生物持留能力兩種因素考慮,前者是DAMO微生物富集培養(yǎng)過程中更為關(guān)鍵的限制因素。 【關(guān)鍵詞】：反硝化型甲烷厭氧氧化(DAMO) 富集培養(yǎng) 接種物 培養(yǎng)基 反應(yīng)器構(gòu)型
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：X703
【目錄】：

• 致謝6-7
• 序言7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-34
• 引言16-17
• 1.1 SAMO研究進(jìn)展17-24
• 1.1.1 SAMO過程的研究歷史17-18
• 1.1.2 SAMO發(fā)生機(jī)理18-22
• 1.1.3 參與SAMO過程的微生物22-24
• 1.1.4 目前存在的問題24
• 1.2 DAMO研究進(jìn)展24-29
• 1.2.1 DAMO過程的研究歷史24-25
• 1.2.2 DAMO發(fā)生機(jī)理25-27
• 1.2.3 DAMO參與微生物27-28
• 1.2.4 DAMO富集培養(yǎng)物28-29
• 1.3 本課題研究的意義與內(nèi)容29-34
• 1.3.1 研究意義29-31
• 1.3.2 研究內(nèi)容31-32
• 1.3.3 技術(shù)路線32-34
• 第二章 不同接種物富集培養(yǎng)DAMO微生物的比較研究34-48
• 引言34
• 2.1 材料與方法34-39
• 2.1.1 接種物34-35
• 2.1.2 培養(yǎng)基35
• 2.1.3 富集培養(yǎng)35-36
• 2.1.4 活性測試36
• 2.1.5 DNA抽提與PCR擴(kuò)增36-37
• 2.1.6 克隆與測序37
• 2.1.7 16S rRNA基因與pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析37-38
• 2.1.8 實時熒光定量PCR(qPCR)38
• 2.1.9 熒光原位雜交(FISH)38-39
• 2.1.10 分析方法39
• 2.2 結(jié)果39-44
• 2.2.1 NC10門細(xì)菌的富集39-41
• 2.2.2 富集培養(yǎng)物DAMO活性測試41
• 2.2.3 16S rRNA基因與pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析41-43
• 2.2.4 定量分析43-44
• 2.2.5 FISH44
• 2.3 討論44-47
• 2.4 結(jié)論47-48
• 第三章 不同培養(yǎng)基對DAMO微生物富集培養(yǎng)的比較研究48-58
• 引言48
• 3.1 材料與方法48-50
• 3.1.1 接種物48-49
• 3.1.2 培養(yǎng)基49
• 3.1.3 富集培養(yǎng)49
• 3.1.4 活性測試49
• 3.1.5 DNA抽提與PCR擴(kuò)增49-50
• 3.1.6 克隆與測序50
• 3.1.7 16S rRNA基因與pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析50
• 3.1.8 qPCR50
• 3.1.9 FISH50
• 3.1.10 分析方法50
• 3.2 結(jié)果50-55
• 3.2.1 富集培養(yǎng)50-51
• 3.2.2 活性測試51-52
• 3.2.3 16S rRNA基因和pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析52-54
• 3.2.4 qPCR54
• 3.2.5 FISH54-55
• 3.3 討論55-57
• 3.4 結(jié)論57-58
• 第四章 不同構(gòu)型反應(yīng)器富集培養(yǎng)DAMO微生物的比較研究58-70
• 引言58
• 4.1 材料與方法58-61
• 4.1.1 接種物58-59
• 4.1.2 實驗裝置59-60
• 4.1.3 培養(yǎng)基60
• 4.1.4 DAMO活性測試60
• 4.1.5 DNA抽提與PCR擴(kuò)增60
• 4.1.6 克隆與測序60-61
• 4.1.7 NC10門細(xì)菌數(shù)量分析61
• 4.1.8 16S rRNA基因和pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析61
• 4.1.9 FISH61
• 4.1.10 分析方法61
• 4.2 結(jié)果61-66
• 4.2.1 反應(yīng)器容積氮去除情況61-62
• 4.2.2 DAMO活性62-64
• 4.2.3 NC10門細(xì)菌數(shù)量64
• 4.2.4 16S rRNA基因與pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析64-66
• 4.2.5 FISH66
• 4.3 討論66-68
• 4.4 結(jié)論68-70
• 第五章 結(jié)論與展望70-72
• 5.1 主要結(jié)論70-71
• 5.2 創(chuàng)新點71
• 5.3 建議和展望71-72
• 參考文獻(xiàn)72-82
• 個人簡歷82-83
• 碩士階段取得的科研成果83-85

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