mcrA基因的克隆及其在分析沼氣池產(chǎn)甲烷菌多樣性中的應(yīng)用研究

【摘要】： 產(chǎn)甲烷菌是嚴(yán)格厭氧菌,利用傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法對其進(jìn)行研究費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而近代發(fā)展起來的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),則避免了這些缺點(diǎn)和不足。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢在環(huán)境微生物的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了沼氣池微生物總DNA的提取方法,經(jīng)過檢驗(yàn),可滿足本研究的需要。本研究通過對產(chǎn)甲烷菌特有mcrA基因的RFLP分析、mcrA基因的熒光定量分析以及16S rDNA的DGGE分析等分子生物學(xué)方法對農(nóng)村戶用沼氣池中的產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量進(jìn)行了研究。首先擴(kuò)增了沼氣池中產(chǎn)甲烷菌甲基輔酶M還原酶α亞基(mcrA)基因片段,建立產(chǎn)甲烷菌mcrA基因文庫,對陽性克隆用限制性內(nèi)切酶PstⅠ進(jìn)行RFLP分析,酶切后1、2、3、4號沼氣池分別得到3、4、4、2種OTU(operational taxonomic unit),從每一類型OTU中選取1-2個(gè)單克隆測序后進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明,農(nóng)村戶用沼氣池中存在不同的產(chǎn)甲烷菌類群,1號沼氣池中主要有Methanogenium、Methanocorpusculum和Methanosarcina;2號池中有Methanogenium、Methanocorpusculum、Methanobacterium和未培養(yǎng)菌屬;3號池中有Methanospirillum、Methanobacterium和未培養(yǎng)菌屬;4號池中有Methanogenium和Methanobacterium。 通過Touch-down PCR策略擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌16S rDNA序列進(jìn)行DGGE分析,結(jié)果表明,正常發(fā)酵產(chǎn)氣的沼氣池中存在不同的產(chǎn)甲烷菌類群,并不同程度的存在優(yōu)勢菌群。幾個(gè)沼氣池中均有甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷袋狀菌屬(Methanoculleus)的分布,還存在著一些分類地位不明確的Uncultured euryarchaeote等菌屬。DGGE分析與RFLP分析雖然都是擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌特異的DNA序列,但對兩者結(jié)果的比較分析方面來看mcrA基因片段似乎更能特異地用來分析產(chǎn)甲烷菌。 本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)方法對各沼氣池中存在的產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量進(jìn)行了研究。設(shè)計(jì)了擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌mcrA基因的特異性引物對qMCR-F/qMCR-R,擴(kuò)增后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對沼氣池中的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行絕對定量。結(jié)果顯示,各沼氣池中產(chǎn)甲烷菌數(shù)量在105～108個(gè)/mL之間。 【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)甲烷菌 群落多態(tài)性 mcrA RFLP DGGE qPCR
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：S216.4;Q93
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 研究背景12
• 1.2 研究目的和意義12-13
• 1.2.1 研究目的12-13
• 1.2.2 研究意義13
• 1.3 國內(nèi)外研究進(jìn)展13-21
• 第二章 產(chǎn)甲烷菌mcrA 基因的RFLP 分析21-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.1 主要試劑和儀器21
• 2.1.2 樣品采集21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-25
• 2.2.1 樣品微生物總DNA 的提取21-22
• 2.2.2 mcrA 基因的PCR 擴(kuò)增22
• 2.2.3 PCR 產(chǎn)物的回收和純化22-23
• 2.2.4 mcrA 克隆文庫的構(gòu)建23-24
• 2.2.5 mcrA 基因的RFLP 分析24-25
• 2.2.6 測序及系統(tǒng)發(fā)育分析25
• 2.3 結(jié)果25-31
• 2.3.1 樣品微生物總DNA 的提取25
• 2.3.2 PCR 擴(kuò)增25
• 2.3.3 PCR 產(chǎn)物的回收和純化25-27
• 2.3.4 克隆文庫的構(gòu)建及陽性克隆的篩選鑒定27-28
• 2.3.5 酶切分析28-29
• 2.3.6 測序及系統(tǒng)發(fā)育分析29-31
• 2.4 討論31-32
• 第三章 沼氣池中產(chǎn)甲烷菌的DGGE 分析32-40
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料32
• 3.1.1 主要試劑和儀器32
• 3.1.2 樣品來源32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-35
• 3.2.1 樣品微生物總DNA 的提取32
• 3.2.2 16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增32-33
• 3.2.3 產(chǎn)甲烷菌 16S rDNA 的 DGGE 分析33-34
• 3.2.4 優(yōu)勢條帶的回收及克隆文庫的構(gòu)建34-35
• 3.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析35
• 3.3 結(jié)果35-39
• 3.3.1 DNA 提取35-36
• 3.3.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)36
• 3.3.3 回收和純化36
• 3.3.4 DGGE 分析36-38
• 3.3.5 優(yōu)勢條帶的回收及克隆文庫的構(gòu)建38
• 3.3.6 測序及系統(tǒng)發(fā)育分析38-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 產(chǎn)甲烷菌mcrA 基因的熒光定量分析40-48
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 4.1.1 樣品采集及樣品總DNA 的提取40
• 4.1.2 主要試劑和儀器40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 4.2.1 引物設(shè)計(jì)40-41
• 4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建41-42
• 4.2.3 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化42
• 4.2.4 熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線的建立42-43
• 4.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立43
• 4.2.6 熔解曲線分析43
• 4.3 結(jié)果與討論43-48
• 4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建43-45
• 4.3.2 擴(kuò)增曲線的建立45
• 4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立45
• 4.3.4 熔解曲線分析45-48
• 第五章 全文結(jié)論、工作不足與展望48-50
• 5.1 全文結(jié)論48-49
• 5.1.1 沼氣池微生物總DNA 的提取48
• 5.1.2 PstⅠ酶切分析48
• 5.1.3 群落多態(tài)性的DGGE 分析48
• 5.1.4 RFLP 與DGGE 的比較分析48
• 5.1.5 熒光定量分析48-49
• 5.2 不足與展望49-50
• 5.2.1 mcrA 基因RFLP 分析49
• 5.2.2 熒光定量不足與解決辦法49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 附錄56-60
• 致謝60-61
• 作者簡歷61

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沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落動(dòng)態(tài)研究進(jìn)展    崔曉龍;張無敵;王永霞;尹芳;肖煒;趙興玲;田光亮;董明華;楊斌;

不同原料配比產(chǎn)氣效果及沼液中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)研究    張娟

水體微生物多樣性PCR-DGGE分析方法的比較研究    向少能;陳琳;何曉麗;陳章寶;

PCR-DGGE技術(shù)在城市污水化學(xué)生物絮凝處理中的特點(diǎn)    王峰,傅以鋼,夏四清,楊殿海

PCR-DGGE技術(shù)解析生物制氫反應(yīng)器微生物多樣性    邢德峰,任南琪,宮曼麗

不同16SrDNA靶序列對DGGE分析活性污泥群落的影響    邢德峰;任南琪;宋佳秀;曲敏;徐香玲;

用于分子生態(tài)學(xué)研究的堆肥DNA提取方法    楊朝暉;肖勇;曾光明;劉云國;鄧久華;

激活甲烷菌的微量元素及其補(bǔ)充量的確定    李亞新,董春娟

降解五氯酚厭氧生物反應(yīng)器微生物種群結(jié)構(gòu)的分子特性研究    任艷紅,徐向陽,唐全

富集培養(yǎng)甲烷菌對提高沼氣產(chǎn)氣率的作用    劉維樹,周清香

廢棄秸稈生物氣化的實(shí)驗(yàn)研究    周嶺,李文哲

網(wǎng)箱養(yǎng)殖青石斑魚Epinephelus awoara鰓及體表粘附菌群的PCR-DGGE比較分析    劉玉春;周志剛;石鵬君;何夙旭;姚斌;韓少鋒;

溫度對沼氣菌群產(chǎn)氣能力的影響及菌群變化的研究    王華;楊光;劉小剛;羅華;

一株耐酸堿嗜熱產(chǎn)甲烷菌的分離與系統(tǒng)發(fā)育分析    胡亞東;袁月祥;閆志英;廖銀章;劉曉風(fēng);賀蓉娜;張洪森;官家發(fā);朱聯(lián)碧;

MFC中瘤胃微生物降解纖維素產(chǎn)電的研究    應(yīng)明;牛力華;萬子路;

厭氧消化菌群的篩選及其對高濃度玉米秸稈的厭氧消化    李佳;陳澤兵;李云;楊秀山;

兩相厭氧工藝應(yīng)用的述評    俞漢青;顧國維;

制藥廢水中產(chǎn)甲烷菌的分離與鑒定    郭立峰;李永峰;高大文;

厭氧生物處理技術(shù)的原理及其在城市污水處理中的應(yīng)用    李紹衡

低溫下EGSB反應(yīng)器運(yùn)行研究    閻中;林秀軍;朱民;

產(chǎn)甲烷菌分離純化過程中存在的問題分析    李輝;

《農(nóng)村沼氣技術(shù)500問》摘選    任濟(jì)星;

低溫產(chǎn)甲烷菌的研究現(xiàn)狀    宋素琴;張志東;顧美英;房世杰;

牛糞沼氣發(fā)酵過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化、微生物生理群變化及產(chǎn)甲烷菌多樣性研究    汪婷;何健;趙子如;李順鵬;

淹水和旱作稻田土壤中產(chǎn)甲烷菌的多樣性分異    崔中利;王英;滕齊輝;張斌;曹慧;

瘤胃甲烷調(diào)控方法評述    劉開朗;王加啟;卜登攀;李旦;趙圣國;于萍;

牛糞沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的RFLP分析    何健;汪婷;梅琴;李順鵬;

PCR-DGGE技術(shù)在水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌多樣性探索中的應(yīng)用    劉園園;王士長;

沼氣池快速啟動(dòng)方法探討    王存良;

稻鴨復(fù)合生態(tài)種養(yǎng)對產(chǎn)甲烷菌種群數(shù)量的影響    鄧曉;李勤奮;

高原濕地甲烷產(chǎn)生的生物學(xué)機(jī)制及其分子生態(tài)學(xué)研究    田建卿;田建卿;王艷芬;東秀珠;吳寧;陳槐;

沼氣發(fā)酵工藝參數(shù)對沼氣及沼液成分影響的實(shí)驗(yàn)研究    劉榮厚;郝元元;葉子良;王遠(yuǎn)遠(yuǎn);沈飛;武麗娟;

防控豬鏈球菌病 沼氣池立大功    旺雯

沼氣池漏氣咋辦    高春奇

沼氣池筑起豬鏈球菌病“防火墻”    劉俊明

沼氣池易漏部位及其原因    徐成文

農(nóng)村沼氣池建設(shè)勢在必行    王紹國 郭青 杜欣

怎樣檢查沼氣池是否合格    

小沼氣帶來大變化    本報(bào)記者　朱雋

農(nóng)村能源    宋張尹

點(diǎn)燃山區(qū)致富之光    本報(bào)記者　 徐建

漢濱區(qū)萬余沼氣池裝點(diǎn)新農(nóng)村    通訊員 張修才 劉貴成

瘤胃產(chǎn)甲烷菌定量檢測與微生物菌群調(diào)控研究    郭嫣秋

晉南牛和山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性研究    裴彩霞

厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及其代謝與菌群變化的研究    成艷芬

絞股藍(lán)皂甙對山羊瘤胃菌群及微生物發(fā)酵特性和甲烷產(chǎn)量的影響    王新峰

水和乳化液對煤層產(chǎn)甲烷菌群活性影響研究    肖棟

厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的組成及其代謝產(chǎn)物的特征    周蕾

高溫油藏微生物群落結(jié)構(gòu)及石油烴厭氧降解產(chǎn)甲烷體系構(gòu)建研究    Mbadinga Serge Maurice

污泥厭氧消化過程中乙酸累積的微生態(tài)機(jī)理研究    許科偉

褐煤本源菌生氣特征及其作用機(jī)理    王愛寬

內(nèi)蒙古白絨山羊甲烷產(chǎn)生量估測模型的建立及其影響因素的研究    郭雪峰

mcrA基因的克隆及其在分析沼氣池產(chǎn)甲烷菌多樣性中的應(yīng)用研究    徐彥勝

豬后腸產(chǎn)甲烷菌群多樣性及其與乙酸生成關(guān)系的研究    楊翠鳳

提高產(chǎn)甲烷菌活性的應(yīng)用研究    呂映輝

南方紅黃壤地區(qū)土壤微生物碳素循環(huán)相關(guān)基因多樣性研究    陳森林

低溫產(chǎn)甲烷菌群分析    王宇珊

沼氣池中產(chǎn)甲烷菌的分離鑒定及其分布的研究    崔曉光

低溫對沼氣菌群產(chǎn)氣能力的影響以及產(chǎn)甲烷菌的分離    楊光

沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌分子多樣性研究及產(chǎn)甲烷菌的分離    汪婷

不同原料配比產(chǎn)氣效果及沼液中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)研究    張娟

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