基于滲濾液沉積物的甲烷氧化反硝化耦合微生物學機理研究

【摘要】：長期處于高濃度有機物和高濃度氨氮脅迫下的滲濾液收集池沉積物是一種極端環(huán)境。這種特殊的生境中可能存在著特異性代謝的微生物類群,尤其是耐高濃度有機質(zhì)和氨氮的碳氮元素轉(zhuǎn)化微生物。近年來,甲烷氧化反硝化耦合(Methane oxidation coupled to denitrification, MOD)過程由于其耗能少,反應(yīng)器設(shè)計簡單,受到了研究者的廣泛關(guān)注,但是其微生物學機理還未有明確定論。本研究以浙江省東陽市生活垃圾填埋場16年齡滲濾液收集池沉積物(0-8cm層)為研究對象,采用現(xiàn)代分子生物學技術(shù),詳細分析了高濃度氨氮和有機物脅迫下的滲濾液沉積物原核微生物群落結(jié)構(gòu)、組成多樣性,及其潛在的微生物代謝過程；以該滲濾液沉積物為接種體,在微好氧條件下開展了MOD污泥的富集培養(yǎng)及其甲烷氧化與反硝化耦合性能研究；并以功能基因-分子克隆技術(shù)探索了富集的MOD功能微生物群落結(jié)構(gòu)與耦合機理。研究結(jié)果對開發(fā)微生物種質(zhì)資源以及廢水生物處理新工藝具有重要的現(xiàn)實意義。研究主要結(jié)論如下： (1)以東陽市垃圾填埋場16年齡滲濾液收集池沉積物(0-8cm層)為研究對象,采用PCR-分子克隆技術(shù)結(jié)合16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析闡明了滲濾液沉積物中的古菌群落結(jié)構(gòu)與組成多樣性,并發(fā)現(xiàn)滲濾液沉積物中可能存在氨氧化古菌。通過對隨機挑選的425個古菌克隆子的59個基因型系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)滲濾液沉積物中的古菌分屬廣古菌門(Euryarchaeota)和泉古菌門(Crenarchaeota);其中屬于廣古菌門基因型45個,代表了397個古菌16SrRNA基因克隆,占庫容的93.41%,與產(chǎn)甲烷古菌有較高的同源性,主要為甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)和甲烷桿菌目(Methanobacteriales)產(chǎn)甲烷古菌,并以甲烷鬃菌屬(Methanosaeta spp.)為優(yōu)勢種群。14個泉古菌門基因型代表了28個古菌16S rRNA基因克隆,與環(huán)境樣品來源的序列同源性較高。泉古菌門克隆B9與Candidatus 'Nitrosophaera gargensis'同源性高達98.3%。 (2)細菌16S rRNA基因克隆文庫揭示了滲濾液沉積物中有機質(zhì)降解與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物的群落結(jié)構(gòu)。多樣性指數(shù)分析表明,滲濾液沉積物中細菌的多樣性明顯高于古菌,群落結(jié)構(gòu)也更復雜。代表313個細菌16S rRNA基因克隆的244個基因型,分屬于18個細菌分類門。厚壁菌門(Firmicute)和變形菌門(Proteobacteria)細菌是滲濾液沉積物的主要細菌類群,分別占克隆文庫庫容的21.60%和19.20%。細菌克隆中超過50%的基因型與未培養(yǎng)微生物同源性較高。部分基因型與Genbank中已發(fā)表的序列同源性較低,在系統(tǒng)發(fā)育學上可能屬于新的微生物類群。α-、β-和γ-變形菌亞綱的部分基因型與化能有機營養(yǎng)型反硝化菌同源性較高,推測這些細菌在滲濾液沉積物碳氮元素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用。厚壁菌門(Firmicute)梭菌綱(Clostridia)的發(fā)酵型細菌、產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸菌等化能有機營養(yǎng)型細菌能夠為產(chǎn)甲烷古菌提供H2,CO2,甲基化合物和乙酸等底物,構(gòu)成了滲濾液沉積物中的產(chǎn)甲烷菌群。氨氧化古菌和氨氮利用型細菌可能具有轉(zhuǎn)化氨氮的功能,并因此形成一個低濃度氨氮小生境,從而減輕或者避免了滲濾液沉積物中高濃度氨氮對其他微生物的抑制或毒害作用。盡管滲濾液沉積物細菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)與其他文獻報道的滲濾液微生物群落有一定的相似性,但由于滲濾液水質(zhì)和氣候等條件的不同,滲濾液與沉積物理化性質(zhì)的差別較大,垃圾滲濾液和沉積物中的微生物群落組成與結(jié)構(gòu)多樣性存在顯著性差異。 (3)以東陽垃圾填埋場16年齡滲濾液收集池沉積物(0-8cm層)為接種體,甲烷為唯一外加碳源,硝酸鹽和亞硝酸鹽為電子受體,在微好氧條件下,成功富集了以革蘭氏陰性菌為主體的MOD污泥。穩(wěn)定運行階段含MOD污泥反應(yīng)器的反硝化速率為4.5mmol N L-1d-1.血清瓶活性試驗表明提高反應(yīng)器配水溶解氧可顯著促進富集污泥的反硝化活性,首次證實了反應(yīng)器中配水硝酸鹽與亞硝酸鹽的還原是由于好氧反硝化微生物的作用。富集培養(yǎng)與活性試驗水質(zhì)GC-MS分析結(jié)果表明,甲醛、檸檬酸鹽和乙酸鹽是甲烷氧化代謝過程形成的主要有機物。 (4)以甲烷氧化功能基因pmoA和反硝化功能基因nirK分子克隆結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)為研究手段,考察了富集培養(yǎng)的MOD污泥功能微生物群落結(jié)構(gòu)及其基因豐度。結(jié)果表明,富集的MOD污泥中存在大量的甲烷氧化菌和反硝化細菌,甲烷氧化pmoA基因拷貝數(shù)約為反硝化nirK基因拷貝數(shù)的3倍。屬于γ-變形菌亞綱(Gammaproteobacteria)甲基球菌科(Methylococcaceae)的TypeⅠ型甲烷氧化菌是富集培養(yǎng)MOD污泥優(yōu)勢的甲烷氧化菌群,占總細菌16SrRNA基因克隆文庫庫容的37.50%,并以甲基桿菌屬(Methylobacter spp.)和甲基暖菌屬(Methylocaldum spp.)為優(yōu)勢種群；β-變形菌亞綱(Betaproteobacteria)嗜甲基菌科(Methylophilaceae)的甲基營養(yǎng)型好氧反硝化菌是該富集污泥的主要反硝化微生物類群,占總細菌16S rRNA基因克隆文庫庫容的36.76%。 綜上所述,本研究采用功能基因結(jié)合分子克隆技術(shù)首次闡明了MOD微生物學機理：Type I型的γ-變形菌亞綱(Gammaproteobacteria)甲基球菌科(Methylococcaceae)甲基桿菌屬(Methylobacter spp.)和甲基暖菌屬(Methylocaldum spp.)的甲烷氧化菌氧化甲烷,并采用5-磷酸核酮糖途徑(RuMP Pathway)同化碳源產(chǎn)生甲醛、檸檬酸鹽和乙酸鹽等可溶性簡單有機物,在微好氧的條件下,為β-變形菌亞綱(Betaproteobacteria)嗜甲基菌科(Methylophilaceae)的好氧反硝化菌提供電子供體,進行硝酸鹽或亞硝酸鹽的好氧反硝化作用。 【關(guān)鍵詞】：滲濾液沉積物 群落結(jié)構(gòu)與多樣性 甲烷氧化反硝化耦合(MOD) 微生物學機理
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：X703
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-10
• Abstract10-17
• 圖表索引17-20
• Index of Figures and Tables20-23
• 第一章 緒論23-45
• 1.1 沉積物微生物多樣性研究進展23-30
• 1.1.1 沉積物微生物群落組成多樣性23-26
• 1.1.2 沉積物微生物結(jié)構(gòu)多樣性研究26-28
• 1.1.3 沉積物功能微生物多樣性研究28-30
• 1.2 好氧甲烷氧化反硝化微生物研究進展30-40
• 1.2.1 甲烷氧化微生物研究進展31-34
• 1.2.2 反硝化微生物研究進展34-36
• 1.2.3 好氧甲烷氧化反硝化耦合研究進展36-40
• 1.3 本論文的立項依據(jù)及研究意義40-42
• 1.4 研究內(nèi)容及擬解決的關(guān)鍵問題42-45
• 1.4.1 研究內(nèi)容42-43
• 1.4.2 擬解決關(guān)鍵問題43-45
• 第二章 滲濾液沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性研究45-63
• 2.1 引言45-46
• 2.2 材料與方法46-53
• 2.2.1 沉積物采集點概況與樣品采集46-47
• 2.2.2 滲濾液及沉積物理化性質(zhì)分析47
• 2.2.3 沉積物古菌16S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建47-51
• 2.2.4 古菌16S rRNA基因克隆文庫分析51-52
• 2.2.5 古菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析52
• 2.2.6 核酸序列收錄號52-53
• 2.3 結(jié)果與討論53-61
• 2.3.1 滲濾液與沉積物基本理化性質(zhì)53-54
• 2.3.2 沉積物古菌16S rRNA基因克隆文庫分析54-57
• 2.3.3 沉積物古菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析57-61
• 2.4 本章小結(jié)61-63
• 第三章 滲濾液沉積物細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性研究63-83
• 3.1 引言63-64
• 3.2 材料與方法64-66
• 3.2.1 沉積物細菌16S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建64-65
• 3.2.2 沉積物細菌16S rRNA基因克隆文庫分析65
• 3.2.3 沉積物細菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析65-66
• 3.2.4 核酸序列收錄號66
• 3.3 結(jié)果與討論66-81
• 3.3.1 沉積物細菌16S rRNA基因克隆文庫分析66-69
• 3.3.2 沉積物細菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析69-81
• 3.4 本章小結(jié)81-83
• 第四章 滲濾液沉積物甲烷氧化反硝化耦合性能研究83-97
• 4.1 引言83-84
• 4.2 材料與方法84-87
• 4.2.1 富集培養(yǎng)反應(yīng)器設(shè)計84-86
• 4.2.2 批次試驗設(shè)計86
• 4.2.3 分析方法86
• 4.2.4 掃描電鏡分析86-87
• 4.2.5 革蘭氏染色87
• 4.3 結(jié)果與討論87-95
• 4.3.1 富集培養(yǎng)污泥反硝化性能初探87-90
• 4.3.2 富集培養(yǎng)污泥甲烷氧化與反硝化活性研究90-93
• 4.3.4 富集培養(yǎng)污泥掃描電鏡分析93-94
• 4.3.5 富集培養(yǎng)污泥革蘭氏染色鑒定94-95
• 4.4 本章小結(jié)95-97
• 第五章 甲烷氧化反硝化耦合機理研究97-129
• 5.1 引言97-98
• 5.2 材料與方法98-103
• 5.2.1 MOD污泥總細菌群落結(jié)構(gòu)分析98
• 5.2.2 MOD污泥甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)分析98-100
• 5.2.3 MOD污泥反硝化菌群落結(jié)構(gòu)分析100-101
• 5.2.4 實時熒光定量PCR分析101-102
• 5.2.5 核酸序列收錄號102
• 5.2.6 微生物的分離鑒定102-103
• 5.3 結(jié)果與討論103-126
• 5.3.1 MOD污泥克隆文庫分析103-109
• 5.3.2 MOD污泥16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析109-112
• 5.3.3 MOD污泥pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析112-114
• 5.3.4 MOD污泥nirK基因系統(tǒng)發(fā)育分析114-116
• 5.3.5 RT-PCR分析116-121
• 5.3.6 分離菌株的鑒定121-125
• 5.3.7 MOD過程代謝途徑125-126
• 5.4 本章小結(jié)126-129
• 第六章 結(jié)論與展望129-133
• 6.1 研究結(jié)論129-131
• 6.1.1 滲濾液沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性129
• 6.1.2 滲濾液沉積物細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性129-130
• 6.1.3 滲濾液沉積物甲烷氧化反硝化耦合性能130
• 6.1.4 甲燒氧化反靖化精合機理130-131
• 6.2 主要創(chuàng)新點131
• 6.3 研究展望131-133
• 參考文獻133-153
• 作者簡歷、科研成果及獎勵153-154

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