農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的分子解析

【摘要】： 隨著人類社會(huì)的發(fā)展，能源短缺、環(huán)境污染問題日益突出，已嚴(yán)重威脅人類的生存和發(fā)展。沼氣技術(shù)是解決我國農(nóng)村能源危機(jī)和環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。由于傳統(tǒng)研究手段的限制，目前對(duì)沼氣發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)缺乏全面、準(zhǔn)確的了解，從而阻礙了工程和工藝的改進(jìn)進(jìn)程，致使農(nóng)村系統(tǒng)運(yùn)行效率低和可控性差的問題難以解決?，F(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的成功應(yīng)用，為突破這一技術(shù)瓶頸提供了新思路。本論文運(yùn)用基于16S rDNA的克隆文庫分析和DGGE指紋圖譜分析等分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，對(duì)農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。 首先通過對(duì)前人活性污泥的提取方法改進(jìn)，建立了農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥總DNA的有效提取和純化方法，DNA的得率、完整性、質(zhì)量均可滿足分子生態(tài)學(xué)研究的需要。 通過對(duì)PCR-DGGE條件的優(yōu)化，建立了農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥微生物16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE分析體系：25μ1 PCR反應(yīng)體系中，模板量為1ng；采用Touchdown PCR方式；DGGE膠變性劑濃度范圍35％～56％；上樣量為600ng，150V電泳270min，可較為準(zhǔn)確地反映農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥微生物的多樣性和群落組成。 分別構(gòu)建了農(nóng)村戶用沼氣池細(xì)菌和古菌的16S rDNA文庫，通過文庫分析，對(duì)農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的多樣性進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)微生物種類非常豐富，細(xì)菌比古菌表現(xiàn)出更為復(fù)雜的微生物多樣性。不同微生物種群的豐度存在明顯差異，有少數(shù)明顯優(yōu)勢(shì)種群。其中的細(xì)菌，包括72個(gè)種群，大多數(shù)屬于未培養(yǎng)菌，主要分屬于五大類：低G+C革蘭氏陽性菌(Firmicutes)、變形細(xì)菌(Protecobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠屈撓菌(Chloroflexi)和Genera-incertae-sedis-OP11。其中以低G+C革蘭氏陽性菌為主，包含其2個(gè)亞類：梭菌(Clostridia)和芽孢桿菌(Bacilli)，占庫容的54％，其次為擬桿菌占庫容36％；其中的古菌，包括9個(gè)種群，都屬于廣古菌(Euryarchaeota)，包括甲烷鬃菌(Methanosaeta)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum)、甲烷八疊球菌(Methanosarcina)和甲烷盤菌(Methanoplanus)、甲烷囊菌(Methanoculleus)等，一分類地位不明確的Uncultured euryarchaeote和Methanocorpusculum parvum為優(yōu)勢(shì)種群。 利用PCR-DGGE指紋圖譜分析技術(shù)對(duì)農(nóng)村戶用沼氣池中正常池和酸化池的細(xì)菌和古菌微生物群落結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行了比較，并進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤監(jiān)測。結(jié)果顯示：兩種沼氣池中微生物種類都非常豐富，細(xì)菌比古菌表現(xiàn)出更為復(fù)雜的微生物多樣性。不同微生物種群的豐度存在明顯差異，有少數(shù)明顯優(yōu)勢(shì)種群，這與16S rDNA克隆文庫分析結(jié)論基本一致。正常池與酸化池的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，酸化池中梭菌(Clostridia)比重高，而擬桿菌(Bacteroidetes)相對(duì)較少；而兩種池中古菌的群落結(jié)構(gòu)非常相似。由此初步推斷，影響農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵狀況的可能主要是細(xì)菌，而不是古菌；不同時(shí)期，正常池和酸化池中細(xì)菌和古菌的多樣性都基本穩(wěn)定，但部分種群的豐度隨著溫度的變化有所改變，擬桿菌(Bacteroidetes)豐度的隨發(fā)酵溫度升高增加，而梭菌(Clostridial則相反。 本論文初步解析了農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)群落功能提供了科學(xué)依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)我國農(nóng)村沼氣發(fā)酵的高效、可控運(yùn)行奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】：農(nóng)村戶用沼氣池 微生物群落結(jié)構(gòu) 16S rDNA文庫 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：S216.4;S182
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 立題依據(jù)11-12
• 1.2 目的意義12
• 1.3 沼氣發(fā)酵微生物研究進(jìn)展12-16
• 1.3.1 沼氣發(fā)酵微生物12-13
• 1.3.2 沼氣發(fā)酵是多種微生物的協(xié)同作用13-15
• 1.3.3 傳統(tǒng)研究方法的局限性15-16
• 1.4 微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究進(jìn)展16-23
• 1.4.1 克隆文庫法16-17
• 1.4.2 變性梯度凝膠電泳技術(shù)17-18
• 1.4.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析18
• 1.4.4 RAPD法18-19
• 1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR19
• 1.4.6 rDNA的限制性內(nèi)切酶消化分析19-20
• 1.4.7 末端限制片段長度多態(tài)性20
• 1.4.8 熒光原位雜交20-21
• 1.4.9 微生物放射技術(shù)21-22
• 1.4.10 分子生物學(xué)方法綜合運(yùn)用并與傳統(tǒng)研究方法結(jié)合22-23
• 第二章 材料和方法23-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 厭氧活性污泥樣品來源23
• 2.1.2 菌株23
• 2.1.3 培養(yǎng)基23
• 2.1.4 酶及相關(guān)生化試劑23-24
• 2.1.5 主要儀器24
• 2.1.6 溶液的配制24-25
• 2.1.7 引物合成與測序25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-33
• 2.2.1 厭氧活性污泥總DNA提取和檢測26-27
• 2.2.2 16S rDNA文庫構(gòu)建27-29
• 2.2.3 變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)29-33
• 第三章 農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物DGGE分析方法的建立33-44
• 3.1 北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術(shù)示范基地戶用沼氣池的調(diào)查情況33-34
• 3.2 厭氧活性污泥DNA提取方法和純化34-36
• 3.2.1 農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥總DNA的提取34-35
• 3.2.2 農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥總DNA的純化35-36
• 3.3 PCR擴(kuò)增農(nóng)村戶用沼氣池厭氧污泥微生物16S rDNA V3區(qū)36-38
• 3.3.1 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增36-37
• 3.3.2 古菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增37-38
• 3.4 細(xì)菌V3-PCR-DGGE方法的建立38-42
• 3.4.1 通過垂直DGGE確定水平DGGE變性劑濃度范圍38-39
• 3.4.2 DGGE電泳時(shí)間優(yōu)化39-40
• 3.4.3 DGGE上樣量優(yōu)化40
• 3.4.4 PCR模板量優(yōu)化40-41
• 3.4.5 PCR擴(kuò)增方式比選41-42
• 3.5 小結(jié)42
• 3.6 討論42-44
• 第四章 農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物多樣性ARDRA分析44-58
• 4.1 材料和方法44
• 4.1.1 材料44
• 4.1.2 方法44
• 4.2 結(jié)果和分析44-57
• 4.2.1 厭氧活性污泥總DNA提取與純化44-45
• 4.2.2 細(xì)菌16S rDNA文庫的構(gòu)建以及ARDRA分析45-53
• 4.2.3 古菌16S rDNA文庫的構(gòu)建以及ARDRA分析53-57
• 4.3 小結(jié)57-58
• 第五章 DGGE分析農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)58-68
• 5.1 材料58
• 5.1.1 材料58
• 5.1.2 方法58
• 5.2 結(jié)果和分析58-66
• 5.2.1 DNA提取結(jié)果58-59
• 5.2.2 PCR-DGGE指紋圖譜分析不同發(fā)酵狀態(tài)沼氣池細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異59-63
• 5.2.3 PCR-DGGE指紋圖譜分析不同發(fā)酵狀態(tài)沼氣池古菌群落結(jié)構(gòu)差異63-66
• 5.3 小結(jié)66
• 5.4 討論66-68
• 全文總結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 碩士期間發(fā)表的論文77-78
• 致謝78

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