沼氣發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷菌分子多樣性研究及產(chǎn)甲烷菌的分離

【摘要】：沼氣發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)由多種微生物聯(lián)合，交替作用的復(fù)雜生化過(guò)程。在發(fā)酵過(guò)程中，不產(chǎn)甲烷細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌之間，相互依賴，又互相制約，在發(fā)酵過(guò)程中處于平衡狀態(tài)。而在發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝活動(dòng)與相互作用也體現(xiàn)在發(fā)酵反應(yīng)中物料的理化性質(zhì)的改變上。 在沼氣發(fā)酵中，產(chǎn)甲烷菌是沼氣發(fā)酵微生物的核心，作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物鏈的最后一個(gè)成員，分析沼氣發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷菌的變化，對(duì)于了解發(fā)酵程度，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高沼氣產(chǎn)量，具有十分重要的意義。目前已知，自然環(huán)境中的微生物有90-99％是還未可培養(yǎng)的，加之產(chǎn)甲烷菌的嚴(yán)格厭氧性、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，使得通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術(shù)對(duì)產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的分析十分困難，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是16S rDNA分析的方法引入?yún)捬醐h(huán)境微生物群落的研究中，使得快速、全面、準(zhǔn)確地研究厭氧系統(tǒng)內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)的多樣性成為可能。 本文研究了以奶牛糞便為原料的沼氣發(fā)酵過(guò)程中的物料理化性質(zhì)的改變、參與發(fā)酵過(guò)程的六大微生物生理群的數(shù)量變化。同時(shí)采用不依賴于培養(yǎng)的16SrDNA分析的方法研究了沼氣發(fā)酵的不同階段沼液中產(chǎn)甲烷菌的多樣性的變化。并通過(guò)傳統(tǒng)的Hungate厭氧技術(shù)從發(fā)酵液中分離出產(chǎn)甲烷菌并進(jìn)行了初步的鑒定。 一、沼氣發(fā)酵過(guò)程中主要微生物生理群的演替與物料的變化 研究了以奶牛糞便為原料的沼氣發(fā)酵過(guò)程中六大微生物生理群(好氧產(chǎn)酸菌、厭氧產(chǎn)酸菌、好氧氨化菌、厭氧氨化菌、厭氧纖維素降解菌、產(chǎn)甲烷菌)數(shù)量的變化，以及在此過(guò)程中物料理化性質(zhì)的變化。實(shí)驗(yàn)表明：發(fā)酵前期，以好氧微生物活動(dòng)為主，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，厭氧微生物，特別是產(chǎn)甲烷菌的作用越來(lái)越顯著。 在發(fā)酵過(guò)程中，揮發(fā)性有機(jī)酸，全氮、pH、氧化還原電位都發(fā)生變化，其變化與沼液中微生物類群變化相關(guān)。 二、沼液總DNA的提取和純化方法 通過(guò)直接提取法和間接提取法的比較，確立了從沼液中提取總DNA的方法。比較結(jié)果表明，盡管直接提取法的得率要高于間接法，但由于沼液樣品中的腐殖質(zhì)等雜質(zhì)的含量較高，經(jīng)過(guò)純化回收后的直接法提取的總DNA，仍無(wú)法通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法得到所需的片斷，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。而間接法的得率雖然較低，但所得總DNA純度高，無(wú)需純化，即可進(jìn)行后續(xù)操作。 三、沼氣發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷多樣性的變化 采用不依賴于培養(yǎng)的16SrDNA分析的方法研究了沼氣發(fā)酵的不同階段產(chǎn)甲烷菌的多樣性的改變。首先提取了發(fā)酵前、發(fā)酵啟動(dòng)期、盛產(chǎn)期前期、盛產(chǎn)期、發(fā)酵末期五個(gè)階段的沼液總DNA，應(yīng)用產(chǎn)甲烷菌特異性的16SrDNA引物通過(guò)PCR擴(kuò)增了五個(gè)階段的沼液樣品的總DNA，建立了五個(gè)沼液樣品16SrDNA文庫(kù)，應(yīng)用HaeⅢ-HpaⅡ兩種四堿基限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)五個(gè)文庫(kù)中的16SrDNA片段進(jìn)行了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。共獲得127種酶切類型。應(yīng)用各種多樣性和均度參數(shù)對(duì)五個(gè)文庫(kù)HaeⅢ-HpaⅡ酶切類型的豐富度和分布進(jìn)行了比較。對(duì)五個(gè)文庫(kù)的16SrDNA主要HaeⅢ-HpaⅡ酶 【關(guān)鍵詞】：沼氣發(fā)酵 產(chǎn)甲烷菌 群落變化
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：S216.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 符號(hào)與縮略語(yǔ)說(shuō)明9-10
• 文獻(xiàn)綜述10-35
• 第一章 沼氣發(fā)酵的應(yīng)用現(xiàn)狀10-20
• 第二章 環(huán)境微生物群落研究方法及厭氧環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌多樣性的研究進(jìn)展20-28
• 第三章 產(chǎn)甲烷菌的研究進(jìn)展28-35
• 實(shí)驗(yàn)部分35-88
• 第一章 沼氣發(fā)酵過(guò)程中主要微生物群落變化及物質(zhì)變化35-46
• 1. 材料與方法35-39
• 2. 結(jié)果分析39-43
• 3. 討論43-44
• 4. 參考文獻(xiàn)44-46
• 第二章 沼氣微生物總DNA的提取和純化方法研究46-55
• 1. 材料與方法46-49
• 2. 結(jié)果分析49-51
• 3. 討論51-52
• 4. 參考文獻(xiàn)52-55
• 第三章 沼氣發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)的演替55-73
• 1. 材料與方法56-60
• 2. 結(jié)果分析60-67
• 3. 討論67-70
• 4. 參考文獻(xiàn)70-73
• 第四章 沼氣發(fā)酵基質(zhì)與發(fā)酵沼液中產(chǎn)甲烷菌的分離73-88
• 1. 材料與方法73-77
• 2. 結(jié)果分析77-84
• 3. 討論84-87
• 4. 參考文獻(xiàn)87-88
• 全文總結(jié)88-89
• 附錄89-100
• 致謝100

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低溫沼氣發(fā)酵優(yōu)良菌系的篩選及優(yōu)勢(shì)菌群分析    孔維濤

太陽(yáng)能熱管沼氣發(fā)酵加熱系統(tǒng)研究    杜雙力

消毒劑對(duì)沼氣發(fā)酵影響的試驗(yàn)研究    張京景

高溫菌糠沼氣發(fā)酵的初探及產(chǎn)甲烷菌的分離    路子佳

沼氣發(fā)酵罐內(nèi)攪拌混合過(guò)程試驗(yàn)及CFD模擬研究    王潔

棉稈預(yù)處理及沼氣發(fā)酵系統(tǒng)微生物群落多樣性研究    白云

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預(yù)處理對(duì)小麥秸稈糖化及沼氣發(fā)酵的影響    楊興華