污水處理廠活性污泥中四環(huán)素耐藥基因和耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌研究

【摘要】： 抗生素在人類以及畜禽業(yè)中的濫用導(dǎo)致了環(huán)境中耐藥細(xì)菌大范圍的傳播。因此,為了避免對(duì)公共健康產(chǎn)生影響,本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合細(xì)菌傳統(tǒng)分離培養(yǎng)等方法,分析污水廠水樣中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)的多樣性,并針對(duì)污水廠活性污泥以及自然湖體中的四環(huán)素耐藥基因做基因檢測及量化,以了解本地區(qū)污水廠中耐藥菌所占的比例、活性污泥中四環(huán)素耐藥基因的分布情況以及一般地表徑流中所含有耐藥基因的種類和數(shù)量。 研究結(jié)果顯示,從污水廠所提取的水樣進(jìn)行選擇性培養(yǎng)后看到,在含抗生素平板上,乳糖發(fā)酵型腸桿菌(LFE)中絕大多數(shù)是耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE),占居平板的70%～90%。但是經(jīng)一系列檢測后表明,污水廠的污水處理過程并不能大幅度的減少致病菌的數(shù)量。與此同時(shí),剩余污泥最終卻是經(jīng)過重力濃縮池濃縮后直接裝船外運(yùn),并沒有具體的處理方法?？梢?絕大多數(shù)的致病菌將直接排入環(huán)境。 污水廠進(jìn)水,活性污泥,出水水樣中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)tet基因的出現(xiàn)頻率在0%～69.23%之間?？偣矙z測到:tet(A),tet(B),tet(C),tet(D),tet(E),tet(M),tet(G),tet(X)這八種耐藥基因,沒有檢測到核糖體保護(hù)蛋白編碼的tet(O)和tet(S)基因;乳糖發(fā)酵型腸桿菌(LFE)tet基因的出現(xiàn)頻率在3.7%～68.18%之間,沒有檢測到核糖體保護(hù)蛋白編碼的tet(M),tet(O)和tet(S)基因。 通過對(duì)328株耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)和乳糖發(fā)酵型腸桿菌(LE)的PCR-RFLP分類,測序得到5種不同菌株,分別為大腸桿菌、志賀氏菌、克雷伯氏菌、氣單胞菌和鮑氏不動(dòng)桿菌,其16S rDNA的同源性分別為100%～99%;并用相應(yīng)的tet引物對(duì)其中的某些菌株進(jìn)行再次測序,同源性也都在100%～97%之間,可見此前的實(shí)驗(yàn)研究是科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)并是可信的。 對(duì)污水廠活性污泥中耐四環(huán)素基因在不同季節(jié)和工況下的檢測發(fā)現(xiàn),在不同的時(shí)間點(diǎn),tet基因廣泛分布在活性污泥中,但是污水廠一系列的處理過程也不能有效減少tet基因的種類。同時(shí),經(jīng)過對(duì)滴水湖生物膜上帶有的耐藥基因檢測對(duì)比后證明了污水廠帶有的耐藥基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然界一般地表徑流中的含量。 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行量化,看到閔行污水廠中tet(A)基因濃度要高于tet(C)基因濃度,并且這兩種基因濃度要大大高于自然湖體中攜帶的含量。從中可以看出,也許由于上海甚至是整個(gè)中國地區(qū)對(duì)抗生素藥物的使用及排放沒有做過多的控制,使得本地區(qū)污水中的耐藥基因濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。 最后,對(duì)帶有tet基因的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取后發(fā)現(xiàn),大多數(shù)菌株都含有大小及數(shù)量不等的質(zhì)粒條帶,質(zhì)粒的獲得率大于93.4%。同時(shí)將帶有tet(A),tet(B),tet(C)和tet(D)耐藥基因的質(zhì)粒進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn),其結(jié)果與致病性腸桿菌具有高度同源性。但僅根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的研究深度,未能觀察到攜帶質(zhì)粒的菌株與其耐藥性及耐藥基因之間有明顯關(guān)系這需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步的深入。 【關(guān)鍵詞】：污水廠 耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌 耐藥基因
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：X172
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 引言13-17
• 一、研究意義13-14
• 二、研究目的與內(nèi)容14-15
• 三、研究結(jié)構(gòu)流程圖15-17
• 第二章 文獻(xiàn)回顧17-57
• 引言17
• 一、抗生素進(jìn)入生態(tài)環(huán)境的途徑17-18
• 二、環(huán)境中的抗生素,細(xì)菌和耐藥性18-20
• (一)、環(huán)境中的抗生素18
• (二)、環(huán)境中的細(xì)菌18-19
• (三)、環(huán)境中的抗生素耐藥性19-20
• 三、水環(huán)境中耐藥菌的污染現(xiàn)狀20
• 四、水環(huán)境中耐藥基因傳遞機(jī)制初探20-21
• 五、水環(huán)境中耐藥菌的主要來源21-22
• (一)、醫(yī)院和制藥廠污水排放21-22
• (二)、城市下水道和污水處理廠22
• 六、水環(huán)境中耐藥菌的危害研究22-23
• 七、環(huán)境中的四環(huán)素23-52
• (一)、四環(huán)素的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展24-27
• (二)、四環(huán)素的耐藥性27-52
• 八、水環(huán)境中四環(huán)素存在情況的國內(nèi)外研究進(jìn)程52-54
• 九、總結(jié)54-55
• 十、未來方向55-57
• 第三章 污水處理廠活性污泥中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)的研究57-68
• 簡介57
• 一、乳糖發(fā)酵型腸桿菌(LFE)簡介57-58
• 二、采樣點(diǎn)簡介58-60
• (一)、上海市閔行區(qū)污水處理廠58-60
• (二)、滴水湖60
• (三)、采樣點(diǎn)60
• 三、材料60-61
• (一)、藥品與試劑60
• (二)、相關(guān)儀器60
• (三)、培養(yǎng)基60-61
• 四、方法61
• (一)、細(xì)菌培養(yǎng)61
• (二)、培養(yǎng)基配置61
• 五、結(jié)果與分析61-68
• (一)、菌落基本形態(tài)61-62
• (二)、細(xì)菌總數(shù)62-63
• (三)、不同工況處理后對(duì)TR-LFE和LFE細(xì)菌數(shù)的影響63-64
• (四)、各季節(jié)不同工況處理后對(duì)TR-LFE和LFE細(xì)菌數(shù)的影響64-66
• (五)、本章小結(jié)66-68
• 第四章 污水處理廠活性污泥中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)基因型分析68-88
• 簡介68
• 一、材料68-69
• (一)、菌株68
• (二)、藥品與試劑68-69
• (三)、相關(guān)儀器69
• 二、方法69-72
• (一)、DNA模板制作69
• (二)、PCR反應(yīng)69-71
• (三)、瓊脂糖凝膠電泳71
• (四)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)71
• (五)、PCR產(chǎn)物純化71-72
• (六)、測序鑒定72
• 三、結(jié)果與分析72-88
• (一)、耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)基因型統(tǒng)計(jì)72-81
• (二)、多重耐藥性耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)基因型統(tǒng)計(jì)81-82
• (三)、限制性片段長度多態(tài)性分類分析82-83
• (四)、測序結(jié)果83-86
• (五)、本章小結(jié)86-88
• 第五章 耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)質(zhì)粒DNA對(duì)耐藥基因的驗(yàn)證88-95
• 簡介88
• 一、材料88
• (一)、菌株88
• (二)、藥品與試劑88
• (三)、相關(guān)儀器88
• (四)、培養(yǎng)基88
• 二、方法88-91
• (一)、細(xì)菌培養(yǎng)88
• (二)、抽提質(zhì)粒88-90
• (三)、瓊脂糖凝膠電泳90
• (四)、質(zhì)粒DNA大小的測定90
• (五)、PCR檢測質(zhì)粒攜帶的耐藥性基因90
• (六)、PCR產(chǎn)物純化90
• (七)、測序鑒定90-91
• 三、結(jié)果與分析91-95
• (一)、質(zhì)粒抽提結(jié)果91
• (二)、PCR驗(yàn)證質(zhì)粒攜帶的耐藥性基因91-92
• (三)、測序結(jié)果92-94
• (四)、本章小結(jié)94-95
• 第六章 污水處理廠活性污泥中四環(huán)素耐藥基因的研究95-102
• 簡介95
• 一、材料95-96
• (一)、藥品與試劑95-96
• (二)、相關(guān)儀器96
• 二、方法96-97
• (一)、活性污泥的DNA提取96-97
• (二)、PCR反應(yīng)97
• 三、結(jié)果與分析97-102
• (一)、不同季節(jié)活性污泥中耐藥基因的出現(xiàn)情況97-99
• (二)、污水處理過程中耐藥基因的出現(xiàn)情況99-100
• (三)、滴水湖耐藥基因的相關(guān)情況100
• (四)、本章小結(jié)100-102
• 第七章 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)四環(huán)素耐藥基因的量化102-111
• 簡介102
• 一、材料102
• (一)、藥品與試劑102
• (二)、相關(guān)儀器102
• 二.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測定方法102-104
• (一)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度102-103
• (二)、標(biāo)準(zhǔn)曲線103-104
• (三)、擴(kuò)增曲線104
• 三.結(jié)果與分析104-111
• (一)、閔行污水廠tet(A)和tet(C)基因的量化104-107
• (二)、污水處理過程中tet(A)和tet(C)基因的變化107
• (三)、紫外(UV)消毒前、后的出水樣品107-108
• (四)、滴水湖tet(A)和tet(C)基因的量化108-110
• (五)、本章小結(jié)110-111
• 第八章 總結(jié)和展望111-116
• 一、總結(jié)111-114
• 二、展望與建議114-116
• (一)、展望114
• (二)、建議114-116
• 附錄116-122
• 附錄1 tet基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖116-118
• 附錄2 閔行污水廠活性污泥PCR擴(kuò)增結(jié)果118-120
• 附錄3 閔行污水廠81株TR-LFE菌株質(zhì)粒提取圖譜120-122
• 參考文獻(xiàn)122-134
• 致謝134

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