二神丸中藥物炮制后增強(qiáng)“溫腎暖脾·澀腸止瀉”作用機(jī)理研究

【摘要】：飲片炮制、復(fù)方入藥是中醫(yī)臨床用藥的特色,近年關(guān)于中藥炮制機(jī)理研究逐漸增多,但多以單味藥為主,很少將其納入復(fù)方中研究,導(dǎo)致中藥炮制與中醫(yī)臨床用藥相脫離,不能全面揭示中藥炮制的實(shí)際意義。課題組前期在國家十一五支撐計(jì)劃資助下,對(duì)二神丸中君藥補(bǔ)骨脂鹽炙后引藥入腎,增強(qiáng)溫腎暖脾止瀉的功效做了一些研究。本課題在前期工作基礎(chǔ)上,從復(fù)方的角度出發(fā),研究藥物炮制增效機(jī)理及科學(xué)內(nèi)涵。目的本課題在國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“復(fù)方二神丸中藥物炮制增效機(jī)理研究”(81274085)的支持下,對(duì)復(fù)方二神丸澀腸止瀉的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理進(jìn)行研究。前期研究中,通過藥效篩選出鹽補(bǔ)骨脂和煨肉豆蔻組成的二神丸對(duì)急性腹瀉或脾腎陽虛泄瀉小鼠止瀉效果最佳,且其止瀉有效部位在石油醚部位。本文在前期基礎(chǔ)上,建立符合脾腎陽虛泄瀉證候的大鼠模型,并對(duì)二神丸止瀉有效部位進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià),并基于中醫(yī)辯證施治的治病原則,從“病因-脾腎陽虛”,“病癥-泄瀉”等體現(xiàn)中醫(yī)辨證的“標(biāo)”和“本”來研究補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制品在復(fù)方二神丸中“溫腎暖脾·澀腸止瀉”的作用機(jī)理,為指導(dǎo)臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。方法采用炮制前后組方“藥效一有效部位指紋圖譜—有效成分體內(nèi)代謝排泄過程—作用機(jī)理”對(duì)比研究模式,多角度、多層次地探討補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制在復(fù)方中增效的機(jī)理。1采用文獻(xiàn)研究方法,整理古方二神丸的方源方義、主治脾腎陽虛所致五更瀉的病因病機(jī)及脾腎陽虛泄瀉動(dòng)物模型的現(xiàn)代研究進(jìn)展,為開展二神丸中藥物炮制后增強(qiáng)“溫腎暖脾·澀腸止瀉”作用的機(jī)理研究提供理論依據(jù)。2在文獻(xiàn)整理的基礎(chǔ)上,采用病理病因相結(jié)合的造模方法,通過多項(xiàng)癥候指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià),建立最符合中醫(yī)證候的脾腎陽虛泄瀉大鼠模型。3以脾腎陽虛泄瀉(SKYD)模型大鼠為研究對(duì)象,運(yùn)用髓染色法對(duì)主要臟器進(jìn)行病理檢測和分析,通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)模型大鼠給藥前后的T細(xì)胞亞群(CD3/CD4/CD8)水平進(jìn)行研究,‘探討二神丸中藥物炮制后增強(qiáng)“溫腎暖脾”的作用；4運(yùn)用ELISA(酶聯(lián)免疫檢測)法測定實(shí)驗(yàn)大鼠胃腸激素含量；運(yùn)用16SrRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)大鼠腸道菌群的數(shù)量及種類,觀察二神丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腸道菌群的恢復(fù)情況；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)Western blot跡法等分別從組織水平、基因水平和蛋白水平研究二神丸對(duì)模型大鼠結(jié)腸AQP3表達(dá)的影響,探討二神丸“澀腸止瀉”作用機(jī)理。5通過生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),研究二神丸對(duì)家兔胃腸平滑肌收縮運(yùn)動(dòng)的影響,并觀察其對(duì)4種不同作用機(jī)理的胃腸平滑肌興奮劑(分別作用于M、H1、α及β2受體)的反饋?zhàn)饔?闡明二神丸抑制胃腸收縮的作用靶點(diǎn)。6采用中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)方法對(duì)復(fù)方在體內(nèi)化學(xué)成分進(jìn)行定性定量的分析,通過“血清指紋圖譜研究→定位入血成分→入血成分藥動(dòng)學(xué)研究”路線對(duì)二神丸有效部位的入血成分及其在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)過程進(jìn)行研究；通過核磁共振檢測分析二神丸有效部位給藥后主要排泄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),闡明炮制對(duì)復(fù)方二神丸中藥物成分的體內(nèi)過程的影響。7采用體外實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)二神丸有效部位的入血成分、排泄成分、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的止瀉活性成分等進(jìn)行活性驗(yàn)證,闡明二神丸澀腸止瀉的活性成分及其量效關(guān)系。結(jié)果1經(jīng)“腺嘌呤十飲食失節(jié)(交替喂飼甘藍(lán)和精煉豬脂)+勞倦過度(每日游泳至疲勞)+苦寒瀉下(灌服番瀉葉)”復(fù)合式造模方法處理的實(shí)驗(yàn)大鼠：尿D-木糖排泄率降低、NOS活性和cGMP含量增高,脾臟、腎臟臟器指數(shù)增大,且腎臟有明顯的病理特征,符合脾腎陽虛泄瀉的癥候。2二神丸炮制品石油醚提取物能顯著降低SKYD模型大鼠的腹瀉指數(shù)和小腸推進(jìn)率(P0.05),驗(yàn)證了復(fù)方二神丸“澀腸止瀉”的物質(zhì)基礎(chǔ)為石油醚提取物。二神丸石油醚提取物對(duì)脾腎陽虛癥所致腎臟腫大、腎臟嚴(yán)重病變(如腎小球毛細(xì)血管叢緊閉腎小管壞死、間質(zhì)增生等)病理狀態(tài)起到一定改善作用,并能顯著增加其外周血CD3+, CD3+CD4+百分比含量,減低CD3+CD8+百分比含量(P0.05-0.01),且二神丸中藥物炮制后作用增強(qiáng)。3二神丸石油醚提取物能顯著降低SKYD模型大鼠血清胃動(dòng)素、胃泌素含量,增加腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌含量(P0.01),降低大腸桿菌和糞腸球菌含量(P0.01),提高SKYD模型大鼠結(jié)腸中AQP3的表達(dá)量,且炮制品二神丸組大鼠結(jié)腸AQP3的表達(dá)顯著高于生品二神丸組(P0.05),且對(duì)正常家兔離體十二指腸和回腸的收縮運(yùn)動(dòng)有顯著的抑制作用(P0.01-0.05),主要表現(xiàn)為使腸肌平均張力下降、振幅降低、頻率減少,且二神丸中藥物炮制后作用明顯增強(qiáng)。而二神丸石油醚提取物對(duì)磷酸組胺(HIS)引起的腸肌興奮有明顯的拮抗作用。4二神丸石油醚提取物的主要入血成分是補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚,主要排泄成分是補(bǔ)骨脂酚,與生品二神丸相比,二神丸中藥物炮制后可使補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在血中的最大達(dá)峰時(shí)間提前,最大血藥濃度增高；補(bǔ)骨脂酚總排泄率顯著降低(P0.01)。5主要入血成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及補(bǔ)骨脂酚對(duì)豚鼠回腸平滑肌的平均張力、振幅和頻率與空白組相比無差異；文獻(xiàn)報(bào)道肉豆蔻的止瀉活性成分甲基丁香酚和甲基異丁香酚能顯著降低豚鼠回腸的平均張力,減小振幅和頻率(P0.01),兩者對(duì)豚鼠回腸平滑肌運(yùn)動(dòng)頻率的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.949μmol·L-1 和 3.380 μmol·L-1。結(jié)論鹽炙補(bǔ)骨脂和麩煨肉豆蔻組方的二神丸,可顯著改善脾腎陽虛泄瀉模型大鼠的異常臟器指數(shù),修復(fù)腎臟病理狀態(tài),并通過增高體內(nèi)血清中CD3+, CD3+CD4+及降低CD3+CD8+百分比含量進(jìn)而調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群水平的平衡,最終達(dá)到“溫腎暖脾”作用；可顯著調(diào)節(jié)脾腎陽虛泄瀉模型大鼠的異常胃腸激素水平,并通過扶植腸道正常菌群生長和減低致病菌群來調(diào)整腸道菌群的失調(diào),通過增加結(jié)腸AQP3的表達(dá)量來增強(qiáng)大鼠結(jié)腸對(duì)水的吸收,是通過抗H,受體興奮來抑制胃腸平滑肌的收縮運(yùn)動(dòng),最終達(dá)到“澀腸止瀉”的作用。復(fù)方二神丸中,君藥補(bǔ)骨脂主要以“補(bǔ)”為主,臣藥肉豆蔻以“止瀉”為主,兩者可能共同參與調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。二神丸中藥物炮制后增強(qiáng)“溫腎暖脾·澀腸止瀉”作用可能與減慢補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚在體內(nèi)的消除和分布過程,延長其在體內(nèi)滯留時(shí)間,并減低補(bǔ)骨脂酚的總排泄率,提高了生物利用度有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】：二神丸 溫腎暖脾 澀腸止瀉 作用機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 試劑儀器型號(hào)及批號(hào)6-10
• 中文摘要10-14
• ABSTRACT14-19
• 引言19-21
• 第一章 文獻(xiàn)研究21-35
• 第一節(jié) 二神丸研究進(jìn)展21-26
• 第二節(jié) 脾腎陽虛型泄瀉26-30
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論30
• 參考文獻(xiàn)30-35
• 第二章 二神丸中藥物炮制后“止瀉”藥理作用研究35-55
• 第一節(jié) 脾腎陽虛泄瀉大鼠動(dòng)物模型研究35-44
• 第二節(jié) 二神丸石油醚提取物止瀉作用驗(yàn)證44-49
• 第三節(jié) 二神丸石油醚提取物質(zhì)量控制49-53
• 第四節(jié) 小結(jié)與討論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-55
• 第三章 二神丸“溫腎暖脾,澀腸止瀉”機(jī)理研究55-89
• 第一節(jié) 二神丸“溫腎暖脾”作用機(jī)理研究55-65
• 第二節(jié) 二神丸中藥物炮制增強(qiáng)“澀腸止瀉”作用機(jī)理研究65-86
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論86-87
• 參考文獻(xiàn)87-89
• 第四章 二神丸炮制前后體內(nèi)代謝與排泄比較研究89-113
• 第一節(jié) 二神丸石油醚提取物血清藥物化學(xué)研究89-92
• 第二節(jié) 藥代動(dòng)力學(xué)研究92-101
• 第三節(jié) 復(fù)方二神丸有效部位排泄產(chǎn)物研究101-110
• 第四節(jié) 小結(jié)與討論110-112
• 參考文獻(xiàn)112-113
• 第五章 二神丸入血成分及主要化學(xué)成分止瀉藥效研究113-121
• 第一節(jié) 二神丸入血成分及主要化學(xué)成分止瀉藥效實(shí)驗(yàn)113-115
• 第二節(jié) 止瀉活性成分的量效研究115-118
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論118-120
• 參考文獻(xiàn)120-121
• 結(jié)論與討論121-123
• 附圖123-124
• 綜述124-143
• 參考文獻(xiàn)131-143
• 致謝143-144
• 在讀期間公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、專著及科研成果144-146

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