秸稈纖維素高效降解真菌的篩選、鑒定及其纖維素酶基因克隆

【摘要】： 我國(guó)每年的作物秸稈產(chǎn)出量約6.5億噸,折合纖維素含量約2億多噸,是自然界藴藏最豐富的可再生資源。但是作物秸稈由于組成成分結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,不易降解已經(jīng)成為生產(chǎn)中的障礙,特別在以種植業(yè)為主的地區(qū),秸稈在短期內(nèi)的不易腐解,加上直接還田影響墑情和耕作,導(dǎo)致廢棄和焚燒秸稈遍及廣大農(nóng)村,由此引起環(huán)境污染和嚴(yán)重的資源浪費(fèi),獲取高效降秸稈纖維素的微生物菌株及其制劑的應(yīng)用是解決我國(guó)嚴(yán)峻秸稈問(wèn)題技術(shù)的關(guān)鍵。本文進(jìn)行了秸稈降解微生物的研究,取得了以下主要結(jié)果: 利用稀釋涂平板法從300個(gè)來(lái)自吉林,浙江,四川,河北,北京等地的土壤樣品中初篩到360株秸稈纖維素降解菌,依據(jù)降解菌在平板上降解圈的大小,得到5株降解能力較強(qiáng)的真菌,分別命名為T(mén)1,HD5,HD6,HD7和HD24。這5株真菌均能以秸稈纖維素為唯一碳源良好生長(zhǎng)。通過(guò)形態(tài)觀察、18S rDNA序列分析和ITS序列分析鑒定這5株菌分別屬于肉座菌屬的Hypocrea lixii(Trichoderma harzianum)、曲霉屬的黃曲霉(Aspergillus flavus)、曲霉屬的煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、木霉屬的Trichoderma koningiopsis和青霉屬的草酸青霉(Penicillium oxalicum)。 纖維素降解菌株Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24在固體平板上和液體培養(yǎng)基中都有很好的降解效果。在固體平板上,秸稈纖維素的添加量為1%時(shí),Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24 30℃培養(yǎng)7d,固體平板中央出現(xiàn)明顯的降解透明圈,為20-25mm不等。在液體培養(yǎng)基中,Hypocrea lixii T1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsis HD7和Penicillium oxalicum HD24在第3d全酶活(FPA)均達(dá)到最大,其FPA的最大酶活力分別為25.4U,34.36U,28.85U,31.19U,32.05U,比標(biāo)準(zhǔn)菌株Trichoderma viride(AS3.3711)的酶活力分別高出21.88%,64.87%,38.43%,49.66%,53.79%。它們的最適反應(yīng)溫度均為50℃,但是菌株間產(chǎn)酶的pH值存在差異,菌株T1,HD5,HD6的最適pH值為5,菌株HD7的最適pH值為5.5,而菌株HD24的最適pH值為6。 不同的氮源及其用量影響菌株降解纖維素的FPA活性,確定了菌株最佳的氮源種類(lèi)及其用量:Hypocrea lixiiT1的最佳氮源為NaNO_3,添加量為1.5%;Aspergillus flavus HD5的最佳氮源為(NH_4)_2SO_4,添加量為2%;Aspergillus fumigatus HD6的最佳氮源為(NH_4)_2SO_4,添加量為0.5%;Trichoderma koningiopsisHD7的最佳氮源為(NH_4)_2SO_4,添加量為1.5%;Penicillium oxalicumHD24的最佳氮源為(NH_2)_2CO添加量為1%。 添加0.1%蔗糖對(duì)菌株降解纖維素的FPA活性均呈現(xiàn)抑制作用,而添加0.1%的纖維二糖只對(duì)Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性表現(xiàn)了一定的抑制效應(yīng),明顯提高Penicillium oxalicumHD24的FPA活性;添加0.1%的Tween 20對(duì)Hypocrea lixiiT1, Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性促進(jìn)作用不明顯,但顯著提高了Aspergillus flavus HD5和Penicillium oxalicumHD24的FPA活性。 利用SMART cDNA library Construction技術(shù),構(gòu)建了Hypocrea lixii T1,Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsis HD7的cDNA文庫(kù):通過(guò)抽提總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,PCR合成第二鏈,制備了cDNA的全長(zhǎng)片段,收集500bp以上的片段,與λTriplE載體重組,其庫(kù)容量均達(dá)到10~9pfu/mL,重組載體經(jīng)體外包裝、轉(zhuǎn)染E. coli LE392,在Amp+的抗性培養(yǎng)基上獲得10萬(wàn)多個(gè)λ噬菌斑。利用纖維素底物誘導(dǎo),篩選到了攜帶纖維素外切酶和內(nèi)切酶基因的目的克隆子320個(gè),挑選其中45個(gè)陽(yáng)性克隆子,經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序和比對(duì),獲得3個(gè)新的纖維素酶基因。 采用雙向凝膠電泳(2DE)技術(shù),研究了在相同培養(yǎng)條件下Trichoderma viride AS3.3711,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24的蛋白組學(xué),結(jié)果表明纖維素酶的活性與其蛋白質(zhì)的表達(dá)密切相關(guān),這些菌株的2DE圖譜之間也存在明顯的差異,推測(cè)這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)可能與纖維素酶的種類(lèi)、活性有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】：秸稈纖維素 微生物降解 纖維素酶 cDNA文庫(kù) 蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：S141.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 纖維素和纖維素酶的研究進(jìn)展14-31
• 1.1 秸稈纖維素資源及其性質(zhì)14-18
• 1.1.1 豐富的秸稈纖維素資源14-15
• 1.1.2 秸稈纖維素的組成15-17
• 1.1.3 秸稈纖維素的性質(zhì)17-18
• 1.2 降解纖維素的微生物18-19
• 1.2.1 真菌類(lèi)型18-19
• 1.2.2 細(xì)菌類(lèi)型19
• 1.2.3 放線菌類(lèi)型19
• 1.3 纖維素酶的研究進(jìn)展19-26
• 1.3.1 纖維素降解酶系19-22
• 1.3.2 纖維素酶的結(jié)構(gòu)分類(lèi)22-23
• 1.3.3 纖維素酶的作用機(jī)理23-25
• 1.3.4 纖維素酶基因的克隆及表達(dá)25-26
• 1.4 纖維素酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展26-27
• 1.4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的歷史背景26
• 1.4.2 微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容和方法26-27
• 1.4.3 纖維素酶領(lǐng)域的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展27
• 1.5 秸稈纖維素的應(yīng)用27-29
• 1.5.1 秸稈還田27-28
• 1.5.2 飼用化28
• 1.5.3 制備復(fù)合材料28
• 1.5.4 生物煉制28-29
• 1.6 研究的目的和意義29
• 1.7 研究?jī)?nèi)容、方法和技術(shù)路線29-31
• 1.7.1 本論文研究的內(nèi)容和方法29-30
• 1.7.2 本論文研究的技術(shù)路線30-31
• 第二章 秸稈纖維素降解菌的篩選31-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 2.1.1 樣品來(lái)源31
• 2.1.2 碳源及培養(yǎng)基31-32
• 2.1.3 主要試劑32
• 2.1.4 主要儀器32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 2.2.1 篩選方法32
• 2.2.2 表型特征鑒定32-33
• 2.2.3 18S rDNA 鑒定33-34
• 2.2.4 18S rDNA-5.8Sr DNA-28Sr DNA ITS 序列鑒定34-35
• 2.2.5 18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建35
• 2.2.6 ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建35-36
• 2.3 結(jié)果與分析36-41
• 2.3.1 秸稈纖維素降解菌的篩選36-37
• 2.3.2 分離菌株的生長(zhǎng)特性37
• 2.3.3 分離菌株的形態(tài)觀察37
• 2.3.4 分離菌株的18S rDNA 序列分析37-38
• 2.3.5 基于18S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建38-39
• 2.3.6 基于ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建39-41
• 2.4 討論41-42
• 第三章 秸稈纖維素降解菌液體培養(yǎng)產(chǎn)酶及其影響因素的研究42-52
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基42
• 3.1.2 藥品、試劑42
• 3.1.3 溶液和緩沖液42-43
• 3.1.4 主要儀器43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3.2.1 纖維素粗酶液的制備43
• 3.2.2 纖維素酶活力的測(cè)定43-44
• 3.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制44
• 3.2.4 不同時(shí)間（day）對(duì)降解菌株酶活力的影響44
• 3.2.5 pH 對(duì)降解菌株酶活力的影響44-45
• 3.2.6 溫度對(duì)降解菌株酶活力的影響45
• 3.2.7 氮源對(duì)降解菌株酶活力的影響45
• 3.2.8 碳源對(duì)降解菌株酶活力的影響45-46
• 3.3 結(jié)果分析46-51
• 3.2.1 培養(yǎng)時(shí)間（day）對(duì)降解菌株酶活力的影響46-48
• 3.2.2 pH 值對(duì)降解菌株酶活性的影響48
• 3.2.3 溫度對(duì)降解菌株作用效果的影響48-49
• 3.2.4 氮源對(duì)降解菌株作用效果的影響49-50
• 3.2.5 碳源對(duì)降解菌株作用效果的影響50-51
• 3.4 討論51-52
• 第四章 纖維素降解菌 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建和纖維素酶基因的克隆52-63
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 4.1.1 菌株與λ噬菌體52
• 4.1.2 培養(yǎng)基和抗生素52
• 4.1.3 溶液、緩沖液和試劑52-53
• 4.1.4 RNA 提取準(zhǔn)備工作53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法53-58
• 4.2.1 總RNA 提取53-54
• 4.2.2 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建54-57
• 4.2.3 目的克隆子的篩選57-58
• 4.3 結(jié)果與分析58-62
• 4.3.1 降解菌株總RNA 提取和cDNA 文庫(kù)構(gòu)建部分酶切片段的制備58
• 4.3.2 降解菌株cDNA 文庫(kù)的庫(kù)容量58-59
• 4.3.3 攜帶纖維素酶基因的克隆子的篩選59-62
• 4.4 討論62-63
• 第五章 纖維素分解菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)研究63-70
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料63-65
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基63
• 5.1.2 藥品、試劑63
• 5.1.3 溶液及配置63-65
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器65
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法65-67
• 5.2.1 蛋白質(zhì)的提取65
• 5.2.2 Bradford 法對(duì)蛋白質(zhì)的定量65-66
• 5.2.3 蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳66-67
• 5.2.4 蛋白質(zhì)凝膠掃描和圖像分析67
• 5.3 結(jié)果與分析67-69
• 5.3.1 樣品中蛋白質(zhì)的含量67-68
• 5.3.2 各菌株蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜分析68-69
• 5.3.3 各菌株蛋白質(zhì)差異表達(dá)69
• 5.4 討論69-70
• 第六章 全文結(jié)論70-72
• 6.1 結(jié)論70-71
• 6.2 下一步擬開(kāi)展的工作71-72
• 參考文獻(xiàn)72-83
• 致謝83-84
• 作者簡(jiǎn)歷84

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纖維素降解菌的篩選與高效混合菌群的構(gòu)建    馮炘;裴宇航;周曉飛;解玉紅;

2種還田模式下小麥秸稈腐解菌劑應(yīng)用效果研究    劉海靜;任萍;

竹束單板層積材制造工藝及應(yīng)用性能研究    于子絢

東北地區(qū)秸稈降解工程菌的選育及速腐菌劑的研制    張建峰

降解秸稈微生物菌種的篩選及高效菌群的構(gòu)建    裴宇航

基于動(dòng)物糞便的纖維素分解菌篩選及分解纖維素能力研究    馬海玲

小麥秸稈高效降解菌的篩選及應(yīng)用效果研究    劉海靜

降解木質(zhì)素厭氧菌株篩選及其轉(zhuǎn)化秸稈作用研究    邢巖

馬唐生防菌Col-68（Colletotrichum hanaui）發(fā)酵工藝及菌藥復(fù)配的相關(guān)研究    趙美娜

船蛆中纖維素降解菌群篩選與構(gòu)建、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究    張宇燕

PP/秸稈復(fù)合材料的熱壓成型工藝研究    肖亞航,傅敏士

機(jī)械化秸稈還田技術(shù)及配套機(jī)具(綜述)    夏萍,江家伍

飼料間組合效應(yīng)及其在肉牛飼養(yǎng)中的應(yīng)用    原積友,穆明堂

城市生活垃圾堆肥化處理的現(xiàn)狀、問(wèn)題及解決途徑初探    吳香堯

有機(jī)無(wú)機(jī)肥料對(duì)農(nóng)業(yè)環(huán)境影響述評(píng)    陳防,魯劍巍,萬(wàn)開(kāi)元

九龍江流域畜禽養(yǎng)殖業(yè)的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題及防治對(duì)策探討    張玉珍,洪華生,曾悅,黃金良,陳能汪,黃云鳳,林陽(yáng)

反芻家畜補(bǔ)償生長(zhǎng)能力的研究進(jìn)展    陳志偉,侯先志,趙志恭

現(xiàn)代生物技術(shù)走進(jìn)新時(shí)代    朱效民

綿羊日糧不同碳水化合物比例對(duì)纖維物質(zhì)在消化道不同部位流通量和消化率的影響    譚支良,盧德勛,胡明,牛文藝,韓春艷,任曉萍,凌樹(shù)禮

反芻動(dòng)物葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)代謝研究進(jìn)展    王俊鋒,劉美,徐鳳霞,黃靜龍

纖維素生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展    劉發(fā)來(lái);范建平;蘇士;張子義;

環(huán)境條件對(duì)1株降解廚余垃圾絲狀真菌產(chǎn)酶活性的影響    史琳娜;孔海民;汪繼兵;滕一波;方萍;

日本七鰓鰻(Lampetra japonica)口腔腺表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析    高琪,逄越,吳毓,馬飛,李慶偉

從農(nóng)作物的殘余物中提取飼料纖維素    丁永齊;張立中;Г·Ж、ИБРАЕВ;

生長(zhǎng)獺兔日糧中添加纖維素酶的效果    高振華,張寶慶,趙博偉,鄭艷華

飼料中添加纖維素酶對(duì)團(tuán)頭魴生長(zhǎng)的影響    余豐年,王道尊

纖維素酶的研究和應(yīng)用前景    邱雁臨

纖維素酶的研究進(jìn)展    謝占玲,吳潤(rùn)

飼用纖維素酶活力測(cè)定方法的改進(jìn)    楊潔,阿力木,李福成,毛新芳,葛亮

松材線蟲(chóng)纖維素酶的分離純化及免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究    張奇;馬洪周;楊文博;白鋼;熊惠龍;李海燕;

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素組學(xué)    蔣立平;彭黎;梁宋平;

固體纖維素酶的浸漬條件優(yōu)化及其特性研究    馮文英;

不同來(lái)源的纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的比較研究    黃燕華;馮定遠(yuǎn);

纖維素酶對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響    楊彬;馮定遠(yuǎn);

纖維素酶制劑對(duì)苜蓿青貯飼料品質(zhì)的影響    薛艷林;玉柱;白春生;孫杰;

產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌產(chǎn)酶條件的研究    丁軻;余祖華;程相朝;閆文朝;趙戰(zhàn)勤;王臣;張春杰;王天奇;

產(chǎn)紫青霉HBZ003產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化    王春燕;蔡坤;王化山;周艷艷;劉四新;

全植物纖維復(fù)合材料——Ⅱ.劍麻纖維自增強(qiáng)復(fù)合材料的酶降解性能研究    盧珣;章明秋;容敏智;

不同來(lái)源纖維素酶對(duì)鵝胰腺和小腸內(nèi)容物消化酶活性的影響    黃燕華;馮定遠(yuǎn);

纖維素降解菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件的研究    劉韞滔;禤淑霞;龍傳南;龍敏南;胡忠;

蛋白質(zhì)組學(xué)在美逐步形成市場(chǎng)    記者 吳月輝

抓緊蛋白質(zhì)組學(xué)的研究    

科學(xué)新寵——蛋白質(zhì)組學(xué)    黎明

蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)業(yè)正逐漸形成    前線

蛋白質(zhì)組學(xué)    麥國(guó)榮

首建人類(lèi)器官蛋白質(zhì)組“藍(lán)圖”    王雪飛 吳志軍

為腫瘤疾病的防治研究開(kāi)辟新途徑    特約記者 郝成濤　記者 于春光

為科學(xué)攀登搭建精神高地    本報(bào)特約記者 吳志軍　郝成濤

中科院大連化物所為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供新方法    陽(yáng)光

提高基礎(chǔ)及應(yīng)用研究水平    潘文

豬偽狂犬病鑒別診斷研究與豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列的測(cè)定    唐勇

人參葉和根cDNA文庫(kù)構(gòu)建及表達(dá)序列標(biāo)簽分析    王穎

小尾寒羊多胎性狀相關(guān)基因的鑒定和遺傳研究    柳淑芳

慢性肝病患者組織cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及用SEREX方法篩選HCC抗原    陳曉紅

B型煙粉虱熱休克蛋白基因的克隆和表達(dá)及其與脅迫耐受性關(guān)系的研究    王海鴻

漢坦病毒受體的篩選及鑒定    白文濤

白癜風(fēng)相關(guān)黑素細(xì)胞膜抗原的分析及鑒定    李強(qiáng)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選肝癌血清標(biāo)記物    馮鉅濤

可卡因安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽相互作用蛋白的篩選    陳娟

重型肝炎血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜研究    劉小麗

秸稈纖維素高效降解真菌的篩選、鑒定及其纖維素酶基因克隆    劉娣

纖維素酶水解動(dòng)力學(xué)及影響因素研究    夏安

產(chǎn)耐高溫纖維素酶細(xì)菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究    賀蕓

特異腐質(zhì)霉Humicola insolens（YH-8）纖維素酶的分離純化及性質(zhì)研究    王在貴

尖孢鐮刀菌高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化    王瑋

糖蜜酒精廢液誘導(dǎo)康氏木霉產(chǎn)纖維素酶的研究    林元山

嗜堿性芽孢桿菌Bacillus sp.AC-2產(chǎn)纖維素酶的研究    舒勤

玉米秸稈制取生物乙醇關(guān)鍵技術(shù)的研究    楊敏

產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及不同添加劑在青貯飼料中的應(yīng)用研究    夏友國(guó)

玉米秸稈酶水解及發(fā)酵乳酸的研究    黃愛(ài)玲