降解木質(zhì)素厭氧菌株篩選及其轉(zhuǎn)化秸稈作用研究

【摘要】：秸稈作為可再生資源具有巨大的潛在價值，因其結(jié)構(gòu)復雜自然條件下無法被有效利用，如何有效綜合利用秸稈資源已成為各國亟待解決的問題。 生物法降解有其獨特的優(yōu)勢被人們廣泛采用，目前研究較多的木質(zhì)素降解菌是白腐真菌，并對其所產(chǎn)的三種木質(zhì)素降解酶作了大量研究。然而白腐真菌發(fā)酵時間長，生長受環(huán)境影響很大，在生產(chǎn)實踐中效率并不高。篩選其它高效降解木質(zhì)素菌株對于秸稈資源有效利用具有重要意義。 瘤胃是天然生物反應器，瘤胃微生物能夠降解木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，其中必存在具有降解木質(zhì)素潛力的菌種。本文從牛瘤胃液內(nèi)篩選降解木質(zhì)素的菌株，通過馴化培養(yǎng)提高其木質(zhì)素降解率，并選擇木質(zhì)素降解能力強的菌株RB_1、RB_6，研究其酶學性質(zhì)，優(yōu)化產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶的培養(yǎng)條件，對比研究厭氧菌株及好氧菌株轉(zhuǎn)化秸稈的作用。通過本項研究，得出以下結(jié)論： 1.以木質(zhì)素為唯一碳源，在厭氧條件下從瘤胃液中篩選到降解木質(zhì)素的厭氧菌株，經(jīng)過馴化傳代培養(yǎng)得到木質(zhì)素降解率高的目標菌株RB_1、RB_6。通過生理生化分析及分子生物學鑒定，確定菌株RB_1為大腸埃希氏菌株(Escherichia coli)。菌株RB_6為胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)。 2.檢測菌株RB_1、RB_6發(fā)酵上清液，測定出含一定量的阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase,FAE)和乙酰酯酶(Acetyl esterase, AE)。對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進行單因素試驗和正交優(yōu)化試驗，得到較高酶活力。實驗結(jié)論如下：菌株RB_1在最優(yōu)發(fā)酵條件下，F(xiàn)AE活最高可達到2.189mU/mL，AE活力最高可達到610.08mU/mL。菌株RB_6在最佳培養(yǎng)條件下，F(xiàn)AE酶活最高可達到1.822mU/mL，AE活力最高可達到648.22mU/mL。 3.對菌株RB_1、RB_6所產(chǎn)的FAE、AE進行酶學性質(zhì)研究，結(jié)果如下：兩菌株RB_1、RB_6的FAE的最適宜作用溫度都為40℃，最適pH都在8.0左右，并且在40℃有較好的溫度穩(wěn)定性，pH5.0~8.0范圍有很好的pH穩(wěn)定性。兩菌株RB_1、RB_6的AE的最適宜作用溫度同樣為40℃，pH8.0左右才能保有較高酶活力，酶活穩(wěn)定的pH范圍較窄。10種金屬離子對菌株RB_1的FAE、AE的影響結(jié)果為: Ni+、Cu~(2+)能夠完全抑制FAE活力，F(xiàn)e~(3+)對FAE促進作用最明顯，僅Ca~(2+)對AE都有抑制作用，而Mg~(2+)對AE促進作用最強。10種金屬離子對菌株RB_6的FAE、AE的影響結(jié)果為: Fe~(2+)對FAE影響最顯著，Zn~(2+)可完全抑制FAE，只有Ni~+離子對AE其有促進作用。 4.研究菌種B_7、B_8、B_9、F_3、F_4、F_8、糙皮側(cè)耳以及RB_1、RB_6發(fā)酵秸稈的試驗表明：從降解水稻秸稈木質(zhì)素的能力來看，糙皮側(cè)耳的降解能力最強，木質(zhì)素降解率高達42.33%。厭氧細菌RB_1、RB_6強于好氧細菌B_7、B_8、B_9，弱于真菌F_3、F_4、F_8、糙皮側(cè)耳。從降解玉米秸稈木質(zhì)素的能力來看，木質(zhì)素降解率最高屬F_3，可達31.35%，而厭氧細菌RB_1、RB_6發(fā)酵秸稈的時間遠比其他菌株發(fā)酵時間短，提高了發(fā)酵效率。菌株RB_1、RB_6應用于造紙黑液木質(zhì)素降解研究表明，其對造紙黑液的木質(zhì)素也存在一定的降解能力。 【關鍵詞】：木質(zhì)素 生物降解 阿魏酸酯酶 乙酰酯酶 秸稈
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：X712
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 立題意義13-14
• 1.2 秸稈資源利用的研究現(xiàn)狀14-16
• 1.2.1 秸稈利用的現(xiàn)狀14
• 1.2.2 秸稈利用的限制因素14-16
• 1.2.3 秸稈的預處理技術16
• 1.3 微生物降解木質(zhì)素的研究16-19
• 1.3.1 降解木質(zhì)素的微生物16-17
• 1.3.2 木質(zhì)素的降解酶17-19
• 1.4 瘤胃微生物降解木質(zhì)素的研究19-20
• 1.4.1 瘤胃微生物的介紹19
• 1.4.2 瘤胃的多纖維素酶體19-20
• 1.5 研究內(nèi)容20
• 1.6 研究創(chuàng)新點20-21
• 第2章 降解木質(zhì)素厭氧細菌的篩選及鑒定21-36
• 2.1 引言21
• 2.2 試驗材料21-23
• 2.2.1 主要設備21-22
• 2.2.2 培養(yǎng)基22
• 2.2.3 試劑的配制22-23
• 2.3 試驗方案23-25
• 2.3.1 瘤胃液的采集23
• 2.3.2 菌株的篩選純化23-24
• 2.3.3 菌株的馴化24
• 2.3.4 菌株保藏24
• 2.3.5 生長曲線的繪制24-25
• 2.3.6 菌種鑒定25
• 2.4 結(jié)果與分析25-34
• 2.4.1 分離純化結(jié)果26
• 2.4.2 馴化結(jié)果26-29
• 2.4.3 菌株生長曲線29-30
• 2.4.4 菌種鑒定30-34
• 2.5 討論34
• 2.6 小結(jié)34-36
• 第3章 菌株的酶學試驗研究36-54
• 3.1 引言36
• 3.2 試驗材料36-37
• 3.2.1 菌種36
• 3.2.2 主要試劑36-37
• 3.2.3 培養(yǎng)基37
• 3.2.4 試劑的配制37
• 3.3 試驗方法37-39
• 3.3.1 漆酶檢測法37
• 3.3.2 過氧化物酶檢測法37-38
• 3.3.3 粗酶液的制備方法38
• 3.3.4 阿魏酸酯酶(FAE)活性測定方法38
• 3.3.5 乙酰酯酶(AE)活性測定方法38
• 3.3.6 葡糖糖的標準曲線制作方法38-39
• 3.3.7 發(fā)酵液還原糖的測定39
• 3.4 試驗方案39-40
• 3.4.1 產(chǎn)酶平板顯色試驗39
• 3.4.2 液體培養(yǎng)測定其還原糖動態(tài)變化曲線39
• 3.4.3 檢測發(fā)酵液阿魏酸酯酶和乙酰酯酶39
• 3.4.4 測定阿魏酸酯酶和乙酰酯酶動態(tài)變化曲線39-40
• 3.4.5 酶學性質(zhì)的研究40
• 3.5 結(jié)果與分析40-51
• 3.5.1 產(chǎn)酶平板顯色試驗結(jié)果40
• 3.5.2 發(fā)酵液中還原糖動態(tài)變化40-42
• 3.5.3 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的動態(tài)變化曲線42-43
• 3.5.4 阿魏酸酯酶酶學性質(zhì)研究43-48
• 3.5.5 乙酰酯酶酶學性質(zhì)研究48-51
• 3.6 討論51-52
• 3.7 小結(jié)52-54
• 第4章 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗研究54-67
• 4.1 引言54
• 4.2 試驗材料54
• 4.2.1 菌株54
• 4.2.2 培養(yǎng)基54
• 4.3 試驗方法54-55
• 4.4 試驗方案55
• 4.4.1 單因素試驗55
• 4.4.2 正交優(yōu)化試驗55
• 4.5 結(jié)果與討論55-65
• 4.5.1 發(fā)酵產(chǎn) FAE 條件的優(yōu)化55-58
• 4.5.2 發(fā)酵產(chǎn) AE 條件的優(yōu)化58-64
• 4.5.3 正交試驗結(jié)果驗證64-65
• 4.6 討論65
• 4.7 小結(jié)65-67
• 第5章 菌株轉(zhuǎn)化秸稈的對比研究及應用67-77
• 5.1 引言67
• 5.2 試驗材料67-69
• 5.2.1 菌株67
• 5.2.2 造紙黑液67-68
• 5.2.3 溶液配制68
• 5.2.4 培養(yǎng)基68-69
• 5.3 試驗方法69-70
• 5.3.1 秸稈成分分析方法69
• 5.3.2 造紙黑液木素測定69-70
• 5.4 試驗方案70
• 5.4.1 不同菌株降解玉米秸稈的對比試驗70
• 5.4.2 不同菌株降解水稻秸稈的對比試驗70
• 5.4.3 菌株 RB_1、RB_6造紙黑液降解實驗70
• 5.5 結(jié)果與討論70-75
• 5.5.1 菌株降解秸稈成分分析70-74
• 5.5.2 菌株 RB_1、RB_6造紙黑液木質(zhì)素降解實驗74-75
• 5.6 討論75
• 5.7 小結(jié)75-77
• 第6章 結(jié)論與展望77-80
• 6.1 結(jié)論77-79
• 6.1.1 菌株篩選及鑒定77
• 6.1.2 菌株的酶學試驗77-78
• 6.1.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化試驗78
• 6.1.4 菌株降解秸稈及應用試驗78-79
• 6.2 展望79-80
• 參考文獻80-86
• 致謝86

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