基于FISH技術(shù)的秸稈干發(fā)酵中微生物動態(tài)變化的研究

【摘要】：沼氣發(fā)酵是有機(jī)物在無氧環(huán)境下經(jīng)微生物分解,將其中一部分碳素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳的生物化學(xué)過程。這一過程涉及多種微生物相互協(xié)調(diào),聯(lián)合交替,極為復(fù)雜。在不同發(fā)酵階段,微生物的種類、數(shù)量和代謝活性均有變化,各微生物種群的代謝及相互作用直接影響沼氣發(fā)酵的效率。本文研究了秸稈沼氣干發(fā)酵各階段微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化規(guī)律,以及發(fā)酵溫度對干發(fā)酵過程的影響,探討了微生物群落與基質(zhì)特性之間的關(guān)系,旨在為優(yōu)化秸稈沼氣干發(fā)酵工藝,提高產(chǎn)氣效率提供理論依據(jù)。 1.采用物理、化學(xué)以及酶處理的細(xì)胞破壁方法,提取秸稈沼氣干發(fā)酵基質(zhì)中微生物總DNA,對其純度和得率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：采用凍融處理和酶處理相結(jié)合的破壁處理方法最為有效,DNA純度(A260／A280)和得率分別達(dá)到1.392±0.027和0.143±0.016mg/g; DNA純化試劑盒純化DNA粗提液,比吸附劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)純化的純度提高了34.6%,但A260／A280仍在1.8以下,未能達(dá)到利用PCR分析法對微生物進(jìn)行定量的要求,因此不能作為本實驗中微生物定量測定的有效方法。 2.優(yōu)化了熒光原位雜交技術(shù)(FISH)定量測定秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)中微生物的樣品預(yù)處理條件,并在最優(yōu)條件下做了驗證性實驗。結(jié)果表明：使用無水乙醇作為清洗液,FISH樣品的熒光信號強(qiáng)度和豐度比用PBS清洗液(磷酸緩沖鹽溶液)時有顯著提高；樣品預(yù)處理過程中加無菌玻璃珠震蕩能提高微生物的分散度,從而提高FISH技術(shù)對秸稈厭氧發(fā)酵基質(zhì)中微生物定量的準(zhǔn)確性；采用離心轉(zhuǎn)速為13000r/min時,微生物菌體收集率提高,而且還能保證完好的細(xì)胞形態(tài),為后續(xù)的FISH雜交奠定基礎(chǔ)。 3.以多聚甲醛固定時間、熱固定時間、乙醇脫水時間、雜交溫度、雜交時間為試驗因素進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗,對FISH定量檢測玉米秸稈厭氧干發(fā)酵基料中微生物的最佳雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳的雜交試驗條件為多聚甲醛固定時間18h、熱固定時間15min、乙醇脫水時間3min、雜交溫度44℃、雜交時間1.5h。在該試驗條件下觀察的熒光顯微圖像菌量最多,熒光信號最為強(qiáng)烈,且菌體分辨清晰。 4.研究了溫度對玉米秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)特性及微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的影響,探討了基質(zhì)特性與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。結(jié)果表明：37℃和55℃條件下沼氣發(fā)酵啟動的均較快,乙酸化和甲烷化很快達(dá)到平衡,整個過程未出現(xiàn)明顯的酸積累,反應(yīng)體系的pH值和堿度變化較平穩(wěn),pH始終維持在適宜甲烷化菌生長的范圍；20℃下由于甲烷化菌生長代謝緩慢,不能及時將產(chǎn)生的有機(jī)酸轉(zhuǎn)化成甲烷,造成了一定的酸積累,而過度的酸積累又進(jìn)一步抑制了甲烷化菌的生長繁殖和代謝,導(dǎo)致整個發(fā)酵過程中CH4含量始終處于較低水平；37℃和55℃下的微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯差異,37℃乙酸甲烷菌數(shù)量變化較明顯,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氫甲烷菌的數(shù)量,而55℃下氫甲烷化菌的數(shù)量占優(yōu)勢,說明37℃和55℃下產(chǎn)生甲烷的主要菌群分別是乙酸甲烷菌和氫甲烷化菌；在發(fā)酵前期,各類甲烷化菌的數(shù)量變化不明顯,起主導(dǎo)作用的微生物是產(chǎn)酸型的細(xì)菌,它們將大分子有機(jī)物質(zhì)快速分解成小分子酸,再將小分子酸進(jìn)一步分解成丙酸、乙酸、丁酸；低溫(20℃)、中溫(37℃)和高溫(55℃)發(fā)酵時,甲烷化菌的數(shù)量分別在第24天、第12天和第6天達(dá)到最大。由此可見隨著溫度的升高可使發(fā)酵周期縮短,提前達(dá)到峰值,大大提高了發(fā)酵效率和產(chǎn)氣率。 【關(guān)鍵詞】：秸稈 厭氧干發(fā)酵 FISH技術(shù) 微生物 溫度
【學(xué)位授予單位】：山東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：S216.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-17
• 1.1 秸稈厭氧發(fā)酵微生物分類12-14
• 1.1.1 水解性細(xì)菌12-13
• 1.1.2 纖維素分解菌13
• 1.1.3 半纖維素分解菌13
• 1.1.4 白腐菌13
• 1.1.5 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌13-14
• 1.1.6 產(chǎn)甲烷的微生物14
• 1.2 厭氧發(fā)酵微生物的研究進(jìn)展14-15
• 1.3 沼氣發(fā)酵中微生物的測定方法15-16
• 1.4 本文的主要研究內(nèi)容16-17
• 第二章 秸稈沼氣干發(fā)酵基質(zhì)中微生物DNA提取方法篩選17-26
• 2.1 引言17-18
• 2.2 試驗材料18-19
• 2.2.1 原料18
• 2.2.2 試劑與儀器18-19
• 2.2.3 儀器19
• 2.3 試驗方法19-21
• 2.3.1 總DNA的提取19-20
• 2.3.2 DNA粗提液的純化20
• 2.3.2.1 PVP吸附純化20
• 2.3.2.2 細(xì)菌DNA純化試劑盒純化20
• 2.3.3 DNA質(zhì)量的測定20-21
• 2.3.3.1 DNA純度的測定20-21
• 2.3.3.2 DNA產(chǎn)量的測定21
• 2.4 結(jié)果與分析21-24
• 2.4.1 不同方法提取的DNA純度比較21-22
• 2.4.2 對DNA粗提液的純化結(jié)果22-24
• 2.4.2.1 添加PVP對DNA粗提液的純化效果22-23
• 2.4.2.2 利用純化試劑盒對DNA粗提液進(jìn)行純化23-24
• 2.5 討論24-25
• 2.6 本章小結(jié)25-26
• 第三章 基于秸稈厭氧干發(fā)酵的FISH預(yù)處理條件優(yōu)化26-35
• 3.1 引言26-27
• 3.2 材料與方法27-30
• 3.2.1 樣品來源27
• 3.2.2 主要試劑及儀器27-28
• 3.2.3 樣品預(yù)處理試驗方法28-29
• 3.2.3.1 清洗液成份的確定28
• 3.2.3.2 攪拌方式的確定28
• 3.2.3.3 離心轉(zhuǎn)速的確定28-29
• 3.2.4 熒光原位雜交與計數(shù)29-30
• 3.3 結(jié)果與分析30-33
• 3.3.1 清洗液成份對FISH反應(yīng)效果的影響30-31
• 3.3.2 攪拌方式對FISH反應(yīng)效果的影響31-32
• 3.3.3 離心轉(zhuǎn)速對FISH反應(yīng)效果的影響32-33
• 3.4 討論33-34
• 3.5 本章小結(jié)34-35
• 第四章 秸稈沼氣干發(fā)酵中微生物FISH定量雜交條件優(yōu)化35-50
• 4.1 材料與方法35-41
• 4.1.1 材料35
• 4.1.2 試劑35-36
• 4.1.3 儀器36-37
• 4.1.4 雜交處理試驗方法37
• 4.1.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計37-40
• 4.1.5.1 確定各因素水平上下限37
• 4.1.5.2 心點(零水平)的取值37-38
• 4.1.5.3 查表確認(rèn)實驗設(shè)計參數(shù)38
• 4.1.5.4 根據(jù)參數(shù)計算每個因素的變化區(qū)間△j38
• 4.1.5.5 對每個因素的水平編碼38-39
• 4.1.5.6 雜交處理正交表39-40
• 4.1.6 利用FISH技術(shù)測定微生物數(shù)量40-41
• 4.1.6.1 樣品的預(yù)處理及細(xì)胞固定40
• 4.1.6.2 載玻片的預(yù)處理及細(xì)胞脫水40-41
• 4.1.6.3 熒光原位雜交反應(yīng)41
• 4.2 結(jié)果與分析41-48
• 4.2.1 熒光面積回歸方程的建立42-43
• 4.2.2 熒光面積回歸方程的建立和檢驗43-44
• 4.2.3 熒光面積二次回歸方程的交互作用分析44-48
• 4.3 討論48-49
• 4.4 本章小結(jié)49-50
• 第五章 溫度對秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)特性及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響50-63
• 5.1 材料與方法50-53
• 5.1.1 試驗材料50
• 5.1.2 試驗中所用探針50
• 5.1.3 儀器50-52
• 5.1.4 測定方法52-53
• 5.1.4.1 pH值的測定52-53
• 5.1.4.2 堿度的測定53
• 5.1.4.3 揮發(fā)性脂肪酸的測定53
• 5.1.4.4 氣體分析53
• 5.2 結(jié)果與分析53-62
• 5.2.1 基質(zhì)pH和堿度隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律53-55
• 5.2.2 揮發(fā)性脂肪酸隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律55-57
• 5.2.3 不同溫度對發(fā)酵過程中基質(zhì)VFA/TIC的影響57-58
• 5.2.4 在不同發(fā)酵階段溫度對產(chǎn)氣情況的影響58-60
• 5.2.5 在不同發(fā)酵階段溫度對微生物變化的影響60-62
• 5.3 本章小結(jié)62-63
• 第六章 結(jié)論63-65
• 附錄65-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67-68
• 參考文獻(xiàn)68-71

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