玉米秸稈蛋白發(fā)酵飼料中木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及應(yīng)用

【摘要】：世界上纖維原料資源豐富，將纖維資源轉(zhuǎn)化后可實現(xiàn)生產(chǎn)酒精、單細(xì)胞蛋白等物質(zhì)的目的。這不僅充分利用了自然資源，而且防止了由于纖維原料的丟棄產(chǎn)生的污染。其中纖維原料轉(zhuǎn)化是實現(xiàn)纖維原料合理化利用的重要步驟。纖維原料的轉(zhuǎn)化包括纖維原料的預(yù)處理和纖維素酶的酶解。本文主要從纖維原料秸稈的預(yù)處理及纖維素酶的生產(chǎn)兩個重要方面進(jìn)行了探討。 首先通過單因素實驗確定了玉米秸稈高壓蒸煮鍋中蒸煮的最佳預(yù)處理條件：用堿量為14%、固液比為1:7、保溫溫度為130℃1h＋140℃1h，該預(yù)處理條件下處理后的玉米秸稈其紙漿卡伯值出現(xiàn)最低，殘堿和紙漿得率也較為合理。此時其卡伯值為12.43，制漿得率為56.7%。隨后利用購買的纖維素酶及木聚糖酶對預(yù)處理后的秸稈進(jìn)行酶解，進(jìn)一步確定了上述最佳預(yù)處理條件。利用最優(yōu)預(yù)處理秸稈進(jìn)行酶解，通過一系列實驗確定了最佳酶解條件：三角瓶中裝入100mL漿濃度為3%的預(yù)處理秸稈，纖維素酶用量為100U/g，木聚糖酶用量為600U/g，酶解pH值為4.8，48℃恒溫培養(yǎng)箱中搖瓶酶解72h。此時酶解液中還原糖含量積累達(dá)到最大，為25.6mg/mL。 以實驗室保藏的綠色木霉為出發(fā)菌株，通過兩次紫外與兩次DES的交替誘變對綠色木霉的出發(fā)菌株進(jìn)行了誘變篩選。在以醋酸纖維素鈉為唯一碳源的剛果紅培養(yǎng)基上篩選出一株透明圈較大的菌株Hc=2.1，經(jīng)多次復(fù)篩后，得到了一株生長較好酶活較高的突變株，編號T.viride8140UEUE4-80，其纖維素酶活達(dá)到了22.79U/mL、FDA酶活達(dá)到了2.56U/mL、木聚糖酶活達(dá)到了38.09U/mL，分別比原始菌株提高了2倍、1.5倍和1.3倍。對突變株的傳代穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，得到的突變株產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好，酶活下降極少，說明獲得的突變株T.viride8140UEUE4-80可以用來進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。 對綠色木霉突變株Trichoderma viride8140UEUE4-80的液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實驗通過對菌株液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源、氮源、pH值、金屬離子及表面活性劑的研究，確定了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基中各成分及其含量：1000mL營養(yǎng)鹽成分：(NH4)SO42.0g/L、KH2PO42.0g/L、Urea0.3g/L、Peptone0.75g/L、CaCl20.3g/L、MgSO40.3g/L、FeSO4﹒7H2O5.0mg/L、MnSO4﹒H2O1.6mg/L、ZnSO4﹒7H2O1.4mg/L、CoCl22.0mg/L，微晶纖維素10g/L，麩皮10g/L，吐溫-802mL/L，pH6。實驗通過對菌株液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)條件的研究，包括培養(yǎng)溫度、裝液量與搖床轉(zhuǎn)速、接種方式及接種量。確定了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃、裝液量為50mL/300mL、搖床轉(zhuǎn)速為180r/min、接種方式為種子液接種、接種量為5%。在此培養(yǎng)條件下，以最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后，CMCase達(dá)到24.91U/mL、FPA酶活達(dá)到2.81U/mL、木聚糖酶活達(dá)到105.5U/mL，三種酶活均有明顯提高。 在固體培養(yǎng)下探討了綠色木霉突變株的產(chǎn)酶情況，對產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了實驗，1)對產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源、氮源及無機鹽離子進(jìn)行了研究，確定了最佳固態(tài)培養(yǎng)基成分為：麩皮：秸稈：豆粕=6:3:1、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸銨0.45%、尿素0.15%、無水氯化鈣0.15%、七水硫酸鎂0.2%。 2)固定最佳培養(yǎng)基后，分別對產(chǎn)酶過程中的含水量、裝料量、溫度及接種量進(jìn)行研究，確定了綠色木霉T.viride8140UEUE4-80在三角瓶中最佳固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：固液比為1:2、裝料量為20g/500mL（此時培養(yǎng)基厚度為1cm）、培養(yǎng)溫度為32℃及接種量為10%。在此培養(yǎng)條件下CMCase達(dá)到47.04U/g、FPA酶活達(dá)到10.07U/g、木聚糖酶活達(dá)到1015U/g。 3)在三角瓶固態(tài)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，按在三角瓶中固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，進(jìn)行了曲盒中的擴大培養(yǎng)的研究，綠色木霉在曲盒中固態(tài)培養(yǎng)條件下生長較好，最高CMCase達(dá)到43.3U/g、FPA酶活達(dá)到8.2U/g、木聚糖酶活994U/g?？蛇M(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。 【關(guān)鍵詞】：玉米秸稈 預(yù)處理 綠色木霉 突變 纖維素酶
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：TQ914.3;TQ925
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 文獻(xiàn)綜述14-33
• 0.1 木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)、組成成分及利用情況14-18
• 0.1.1 木質(zhì)纖維的結(jié)構(gòu)與組成成分14-15
• 0.1.2 秸稈資源的利用現(xiàn)狀及應(yīng)用前景15-18
• 0.2 植物纖維的預(yù)處理方式概述18-22
• 0.2.1 物理法18-20
• 0.2.2 化學(xué)方法20-21
• 0.2.3 生物方法21-22
• 0.3 綠色木霉的簡介22-24
• 0.3.1 綠色木霉在發(fā)酵中的應(yīng)用22-23
• 0.3.2 綠色木霉的應(yīng)用前景23-24
• 0.4 纖維素及纖維素酶的概述24-28
• 0.4.1 纖維素概述24-25
• 0.4.2 纖維素酶概述25-28
• 0.5 玉米秸稈蛋白飼料28-29
• 0.5.1 秸稈飼料28-29
• 0.5.2 秸稈蛋白發(fā)酵飼料29
• 0.6 研究內(nèi)容及意義29-33
• 0.6.1 研究意義29-31
• 0.6.2 研究內(nèi)容31-33
• 1 秸稈的預(yù)處理及其酶解33-52
• 1.1 引言33
• 1.2 實驗材料與儀器33-34
• 1.2.1 實驗材料33
• 1.2.2 主要試劑33-34
• 1.2.3 實驗儀器34
• 1.3 實驗內(nèi)容及方法34-38
• 1.3.1 原料的水分測定34
• 1.3.2 玉米秸稈的預(yù)處理34-35
• 1.3.3 制漿得率的測定35
• 1.3.4 黑液中殘堿的測定35
• 1.3.5 卡伯值的測定35
• 1.3.6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定35-36
• 1.3.7 固體酶酶活的測定及酶液制備36-37
• 1.3.8 預(yù)處理后秸稈的酶解37
• 1.3.9 秸稈漿濃度的確定37
• 1.3.10 酶用量的確定37-38
• 2.3.11 酶解時間、酶解溫度、酶解 pH 的確定38
• 2.3.12 酶解后總還原糖含量測定38
• 1.4 結(jié)果與分析38-50
• 1.4.1 預(yù)處理條件的確定38-43
• 1.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線43
• 1.4.3 酶解條件的確定43-50
• 1.5 小結(jié)50-52
• 2 綠色木霉的誘變篩選52-68
• 2.1 引言52
• 2.2 實驗材料與儀器52-54
• 2.2.1 實驗材料52-53
• 2.2.2 實驗儀器53-54
• 2.3 實驗方法54-57
• 2.3.1 菌種培養(yǎng)及纖維素酶菌株的篩選方法54
• 2.3.2 粗酶液提取及酶活測定54
• 2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作54-55
• 2.3.4 菌體生物量的測定55
• 2.3.5 菌種誘變55-57
• 2.4 結(jié)果和分析57-67
• 2.4.1 葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線57
• 2.4.2 出發(fā)菌株的發(fā)酵特性57-59
• 2.4.3 誘變選育結(jié)果59-62
• 2.4.4 變異株 T.viride8140UEUE4-80 與出發(fā)菌株的特性比較62-65
• 2.4.5 誘變菌株穩(wěn)定性研究結(jié)果65-67
• 2.5 小結(jié)67-68
• 3 突變菌株液態(tài)培養(yǎng)下培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究68-81
• 3.1 引言68
• 3.2 實驗材料和儀器68-69
• 3.2.1 實驗材料68
• 3.2.2 實驗儀器68-69
• 3.3 實驗方法及實驗設(shè)計69-71
• 3.3.1 實驗方法69-70
• 3.3.2 實驗設(shè)計70-71
• 3.4 實驗結(jié)果與分析71-80
• 3.4.1 培養(yǎng)基中碳源的影響71-74
• 3.4.2 培養(yǎng)基中氮源的確定74-75
• 3.4.3 培養(yǎng)基的 pH 對產(chǎn)酶的影響75-76
• 3.4.4 金屬離子對產(chǎn)酶的影響76
• 3.4.5 表面活性劑對產(chǎn)酶影響76-77
• 3.4.6 最佳培養(yǎng)基配方77-78
• 3.4.7 培養(yǎng)溫度優(yōu)化78
• 3.4.8 裝液量及搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響78-79
• 3.4.9 接種方式選擇79
• 3.4.10 接種量的選擇79-80
• 3.4.11 最佳培養(yǎng)條件80
• 3.5 小結(jié)80-81
• 4 綠色木霉固態(tài)培養(yǎng)的研究81-95
• 4.1 引言81
• 4.2 實驗材料及儀器81-82
• 4.2.1 實驗材料81-82
• 4.2.2 實驗儀器82
• 4.3 實驗方法82-85
• 4.3.1 菌種培養(yǎng)方法82-83
• 4.3.2 酶活測定83
• 4.3.3 固態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化83-84
• 4.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化84
• 4.3.5 擴大培養(yǎng)84-85
• 4.4 實驗結(jié)果與分析85-94
• 4.4.1 綠色木霉 T.viride8140UEUE4-80 固態(tài)培養(yǎng)下產(chǎn)酶曲線85-86
• 4.4.2 碳源優(yōu)化結(jié)果86-87
• 4.4.3 氮源優(yōu)化結(jié)果87-88
• 4.4.4 無機鹽離子添加優(yōu)化的結(jié)果88-89
• 4.4.5 最優(yōu)培養(yǎng)基89
• 4.4.6 固液比的優(yōu)化結(jié)果89-90
• 4.4.7 裝料量的優(yōu)化結(jié)果90-91
• 4.4.8 溫度對產(chǎn)酶的影響91
• 4.4.9 接種量對產(chǎn)酶的影響91-92
• 4.4.10 最佳培養(yǎng)條件92
• 4.4.11 曲盒中擴大培養(yǎng)的產(chǎn)酶曲線92-94
• 4.5 小結(jié)94-95
• 5 研究結(jié)論與展望95-98
• 5.1 研究結(jié)論95-96
• 5.2 問題及展望96-98
• 參考文獻(xiàn)98-104
• 致謝104-105
• 個人簡歷105
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文105-106

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